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癌症研究
0 次观看 • 6:29 分钟 • April 30th, 2023
— 染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于确定细胞内蛋白质与DNA相互作用的技术。蛋白质会结合到DNA的特定位点，并调控基因表达。首先，使用甲醛稳定DNA-蛋白质复合物。甲醛通过形成共价键将蛋白质交联至相应的DNA序列。
接下来，使用适当的裂解缓冲液裂解细胞，以释放含有交联DNA-蛋白质复合物的染色质。离心悬浮液，并对上清液进行超声处理以获得染色质片段。随后，使用能够特异性结合DNA结合蛋白的合适抗体对样本进行标记。
向样品中加入特异性磁珠。磁珠可识别抗体并与其结合。使用磁铁收集结合了抗体-蛋白-DNA复合物的磁珠。洗涤样品以去除未结合的染色质或抗体。向复合物中加入高盐浓度缓冲液，并在较高温度下孵育，以逆转DNA与蛋白的交联。
使用磁铁收集含有 DNA 和蛋白质的上清液。加入蛋白酶 K 酶以降解样品中的蛋白质。加入适当的缓冲液使 DNA 沉淀，并用于后续分析。以下方案将演示在慢性淋巴细胞白血病细胞中进行染色质免疫沉淀，以鉴定 NFAT2 靶基因。
— 首先，为每份沉淀反应在1.5毫升离心管中准备20微升蛋白A包被的磁珠。将磁珠置于磁力架上静置1分钟，去除上清液。然后每20微升蛋白A包被磁珠用40微升1× ChIP缓冲液1洗涤，通过移液器吹打混匀。
将珠子置于磁力架上静置1分钟，去除上清液。在用原始体积的1×ChIP缓冲液1重悬珠子之前，重复此洗涤步骤三次。向珠子中加入BSA、蛋白酶抑制剂、5×ChIP缓冲液和ChIP-seq级水。接着，加入剪切后的染色质。
使用 10 微克抗 NFAT2 抗体捕获 NFAT2，同时使用 2.5 微克 IgG 抗体作为对照。将混合物在 4 摄氏度、6 RPM 转速的旋转仪上孵育过夜。次日，在 7,000 ×g 条件下离心 5 秒，然后将离心管置于磁力架上孵育 1 分钟。
然后，吸去上清液，并依次用洗涤缓冲液1、2、3和4各洗涤磁珠一次。每次加入缓冲液后，将离心管在7,000 × g下离心5秒，随后将离心管置于磁力架上孵育1分钟。之后，移去上清液，加入下一种洗涤缓冲液。
最后一次洗涤后，将离心管在7,000 × g下离心5秒。将离心管置于磁力架上孵育1分钟。移除上清液，并将磁珠重悬于100 µL洗脱缓冲液1中。然后，将离心管置于旋转轮上孵育30分钟。
接下来，短暂离心收集管中液体，并将离心管置于磁力架上静置1分钟。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，加入4 µL洗脱缓冲液2。为制备输入对照，取1 µL剪切后的染色质与99 µL洗脱缓冲液1和4 µL洗脱缓冲液2混合。然后将样品在65 °C下振荡孵育4小时。
此后，向各管中加入 100 µL 的 100% 异丙醇。涡旋混匀后，在 7,000 ×g 条件下离心 5 秒。然后向每个样品中加入 10 µL 磁珠。涡旋混匀后，将样品置于室温旋转仪上孵育 1 小时。
接下来，短暂离心试管，并将其置于磁力架上静置一分钟。吸除上清液，将磁珠重悬于100微升洗涤缓冲液一中。颠倒试管以混匀，于室温下在旋转仪上孵育五分钟。随后短暂离心试管，再次置于磁力架上静置一分钟，用移液器吸除上清液。
然后，加入 100 µL 洗涤缓冲液二。倒置离心管以混匀，并在室温下于旋转仪上孵育 5 分钟。随后，短暂离心离心管，并将其置于磁力架上静置 1 分钟。通过抽吸去除洗涤缓冲液二，将磁珠重悬于 55 µL 洗脱缓冲液中。
为了洗脱沉淀的DNA，将样品在室温下于旋转轮上孵育15分钟。随后短暂离心，将离心管置于磁力架上1分钟。最后，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。