0 次观看 • 5:21 分钟 • April 30th, 2023
— 造血干细胞和祖细胞（HSPC）具有自我更新能力，并可分化为多种类型的血细胞。在人的一生中，HSPC会逐渐积累DNA突变，这些突变可能促成白血病的发生。为了分析此类突变，通常需要从骨髓中获取HSPC。
首先，将荧光素标记的抗体加入单个核细胞——即从骨髓中分离的成体干细胞——并按照所需时间进行孵育。这些抗体可结合特定的细胞表面标志物，如 CD34。随后，将该混合物上样至荧光激活细胞分选仪（FACS）中。
当激光照射时，荧光素标记的抗体发出荧光。单个细胞液滴通过检测器，检测器测量其荧光强度，并据此使液滴带上电荷。在电磁场作用下，带正电的细胞移向负极容器，反之亦然。
现在，将经FACS分选的CD34阳性HSPC在适当的培养基中培养至所需时间，直至可见克隆形成。接着，通过剧烈吹打使克隆脱落，并离心收集细胞沉淀。将含有克隆性HSPC的细胞沉淀于-20摄氏度保存，以用于后续分析。在以下实验方案中，我们将从单个核细胞中建立HSPC克隆。
— 按照文本方案中所述，首先进行样本材料的制备和染色。随后，配制25毫升造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养基。在384孔细胞培养板的每个孔中加入75微升HSPC培养基。为防止边缘孔中培养基蒸发，将边缘孔加入75微升无菌水或PBS，这些孔不用于细胞分选。
活细胞信号HSPC的正确分选是本方案中最关键的步骤。根据染色样本中10,000个细胞的未染色对照设置HSPC分选的门控。通过在前向散射光高度（FSC-H）与前向散射光面积（FSC-A）比值的线性关系图上圈选单细胞群来设定单细胞门控。
使用未染色的对照组分绘制谱系组分的圈门。绘制 CD34 阳性细胞的圈门，并通过设置针对 CD38 阴性、CD45RA 阴性细胞的特定圈门进一步表征该亚群。将 384 孔板加载到流式细胞分选仪上，进行单细胞分选。如果流式细胞分选仪支持，请启用索引分选数据保存功能，以便后续追溯已分选的细胞。
为了培养单细胞分选的造血干细胞（HSCs），用透明聚乙烯薄膜包裹384孔培养板及其盖子。将384孔板转移至含5%二氧化碳的湿润化37摄氏度培养箱中，孵育三到四周，直至可见克隆形成。培养四周后，确定哪些孔的融合度达到30%或更高。
对于每个克隆，预先在1.5毫米微量离心管中加入1毫升含1% BSA的PBS，并根据对应的孔标记管子。用含1% BSA的PBS预润湿移液枪头，以尽量减少细胞黏附在枪头上的数量。使用设定为75微升的200微升移液器，在反复吹打培养基的同时刮擦孔底，上下剧烈吹打至少五次。
将细胞悬液收集到与孔对应标记的微量离心管中。用最多75微升新鲜的1% BSA和PBS重复吹打孔内液体，以确保细胞最大程度地被回收。克隆培养的细胞可能会贴附在孔底。使用标准倒置光学显微镜检查各孔，确认所有细胞是否均已收集。
如果所有细胞汇合度超过30%的孔均已收获，则将384孔板放回培养箱中。单克隆培养物可增殖长达五周。将细胞悬液在350 × g条件下离心五分钟，应可见少量沉淀。小心吸除上清液，仅保留约五微升。细胞沉淀可在-20 °C冷冻并保存数月，之后再进行DNA提取。