磁激活细胞分选:一种分离 c-Kit 阳性细胞的方法

- c-Kit 或 CD117 是一种酪氨酸激酶跨膜受体，由存在于骨髓和血液中的造血干细胞或祖细胞表达。它也是检测急性髓性白血病的标志物。

为了分离 c-Kit 阳性细胞，收集小鼠腿骨并压碎它们以从内部释放骨髓。过滤骨髓悬液以去除任何骨碎片。将含有骨髓细胞的滤液分层在密度梯度介质上，并离心以将单核细胞与其他组分分离。

将单核细胞的混浊层收集在含有与抗 CD117 小鼠抗体偶联的微珠的试管中。孵育抗体珠复合物，使其与 c-Kit 阳性细胞上的 CD117 受体结合。将孵育的悬浮液穿过放置在磁场中的磁柱。所有用磁性微珠标记的 c-Kit 阳性细胞都保留在柱中，而未标记的细胞则通过。

从磁场中取出色谱柱，并使用合适的缓冲液冲洗内容物以洗脱 c-Kit 阳性细胞。在下面的实验步骤中，我们将展示 c-Kit 阳性细胞从转基因小鼠的骨髓中分离出来的情况。

- 首先，从安乐死的老鼠身上收获腿骨。用手术刀清洁骨头上的组织。然后，将骨头放入冰上的冷 PBS 中，用杵压碎骨头。在此之后，通过 70 微米的细胞过滤器将细胞悬液过滤到带有 10 毫升移液器的 50 毫升螺旋盖管中。用冷 PBS 多次清洗研钵和研杵，并将细胞悬液添加到 50 毫升试管中。

接下来，离心骨髓并用真空和玻璃移液管去除上清液。将细胞沉淀重悬于 5 ml PBS 中。使用移液管，将悬浮的骨髓缓慢添加到室温聚蔗糖的顶部。

之后，在关闭制动器的情况下，以 400 G 的离心多糖 20 分钟。离心后，用移液管收集混浊的总单核细胞界面，并将其转移到新的 15 毫升试管中。用 PBS 将体积调至 10 毫升，并取出 20 微升进行计数。

离心后，弃去上清液，将沉淀置于冰上。接下来，将细胞沉淀重悬于含 EDTA 和 BSA 的 PBS 中。将 CD117 微珠添加到细胞悬液中并涡旋混合。之后，将悬浮液在 10 摄氏度下孵育 4 分钟。然后，将体积增加到 10 毫升，加入更多的 PBS（含 EDTA 和 BSA），并在 4 摄氏度下以 1,200 G 离心 5 分钟。

使用真空除去上清液，并将细胞沉淀悬浮在含有 EDTA 和 BSA 的 PBS 中。然后，将 3 毫升含 EDTA 和 BSA 的 PBS 添加到带有磁柱的磁架中，并使其流入收集管。缓冲液流完柱后，加入细胞悬液，使其通过柱流入收集管。

接下来，向色谱柱中再加入 5 毫升含 EDTA 和 BSA 的 PBS，并立即用柱塞冲洗。取下柱塞并重复冲洗，然后对细胞进行计数。离心细胞后，去除上清液并将细胞沉淀悬浮在完全 IMDM 中进行培养。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养细胞过夜。