0 次观看 • 4:59 分钟 • April 30th, 2023
逆转录病毒是一类RNA病毒，通过逆转录酶将其RNA基因组转化为双链DNA，并永久整合到宿主基因组中进行复制。新的病毒颗粒从细胞中释放出来，可感染其他细胞。癌症基因治疗利用逆转录病毒载体，通过一种称为转导的技术将治疗基因导入靶细胞，以抑制突变基因的表达或清除异常细胞。
为了获得高滴度的逆转录病毒载体，将含有目标逆转录病毒质粒、包装质粒以及合适的转染试剂的转染混合物转染至 HEK 293 细胞中。孵育细胞。转染试剂可促进两种质粒进入细胞。
逆转录病毒质粒编码带有目的基因的病毒基因组，而包装质粒则编码病毒的包膜蛋白。包装细胞的细胞机制形成逆转录病毒颗粒，并将其释放到培养基中。收集病毒上清液，离心以去除细胞。
将所需浓度的病毒颗粒和癌细胞转移至纤维连接蛋白包被的培养板中，以促进病毒包膜蛋白与细胞的结合。孵育细胞后，收集细胞并进行流式细胞术分析转导效率。本方案将实现逆转录病毒介导的c-Kit阳性小鼠骨髓细胞的转导。
— 首先，将逆转录病毒质粒DNA、包装质粒、氯化钙和水加入一个1.5毫升离心管中混匀。然后将500微升HBS加入另一个1.5毫升离心管中。在将转染混合物逐滴加入含有HBS的离心管的同时，使用涡旋振荡器以最低转速持续混匀。
将转染混合物在室温下孵育 20 至 30 分钟。在孵育期间，向 HEK 细胞中加入氯喹，并将细胞置于培养箱中。加入转染混合物后，将细胞在 37 摄氏度、5% CO2 的培养箱中孵育 8 小时，并缓慢加入 14 毫升新鲜的 DMEM 10 培养基以更换细胞培养液。移液时沿培养皿壁缓慢加入，有助于防止 HEK 细胞脱落。
然后将细胞在37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育过夜。使用10毫升注射器收集病毒上清液。接着在注射器上连接一个0.45微米的注射器滤器。将病毒上清液推入新的收集管中。约16小时后再次收集病毒上清液。
此后，向未经处理的6孔培养板中加入2毫升PBS中的重组人纤维连接蛋白片段。次日，用移液器从培养板中移除纤维连接蛋白。用含2% BSA的PBS封闭培养板，并在室温下孵育30分钟。
使用真空泵吸除 BSA，并用 PBS 清洗孔板，然后再次使用真空泵吸除 PBS。随后，立即加入过滤后的病毒上清液，并将孔板离心两小时。用真空泵吸除上清液后，再次离心孔板。
接着，用真空泵吸除上清液，并用 PBS 洗涤病毒包被的孔板。再用真空泵吸除 PBS。将先前培养的 c-Kit+ 小鼠细胞加入病毒包被的孔中。离心后，将细胞在 37 °C 及 5% 二氧化碳条件下孵育。转导 48 小时后，通过离心收集细胞，并重悬于 FACS 缓冲液 1 中。