细胞外嘌呤代谢：基于高效液相色谱法检测白血病细胞中腺苷生成与代谢的实验方法

- 腺苷是一种嘌呤核苷，在生理条件下以外部空间中的微量浓度存在，有助于调控细胞增殖。在白血病等病理条件下，细胞外腺苷浓度升高，抑制针对癌细胞的免疫应答。腺苷的积聚可由三磷酸腺苷（ATP）或二磷酸腺苷（ADP）核苷酸的去磷酸化引起，也可因腺苷无法有效降解为次黄嘌呤核苷（inosine）所致。

为了测量腺苷的生成与消耗，需在存在核苷酸底物的条件下培养癌细胞。细胞的腺苷代谢活性决定了培养体系中多种嘌呤分子的浓度。通过离心去除细胞，从而获得上清液中的嘌呤分子。

为了分离和定量嘌呤，将样品转移至适当的样品瓶中。将其上样到反相高效液相色谱（RP-HPLC）柱中，该色谱柱的固定相上固定有疏水性配体。当样品流经色谱柱时，疏水性分子会吸附到配体上，并根据其疏水性强弱被保留。疏水性最弱的分子最先流出，而疏水性较强的分析物则最后洗脱出来。

研究HPLC色谱图中每种分析物的峰特征有助于确定其在样品中的浓度。在本方案中，我们采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）来定量慢性淋巴细胞白血病细胞中外源性嘌呤代谢产物的含量。

— 为检测AMP消耗以及腺苷和肌苷的生成，将200万细胞（CD19阳性、CD5阳性慢性淋巴细胞白血病细胞）重悬于250微升无血清培养基中，并接种至48孔板。加入250微升400微摩尔AMP，或AMP加抑制剂，使AMP终浓度为200微摩尔。设置无底物的对照组，作为空白样品。

在37摄氏度下孵育30至60分钟。孵育结束后，将500微升上清液收集至预冷的微量离心管中。立即在4摄氏度下以17,000 × g离心5分钟。

将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，随后进行高效液相色谱分析的样品制备，或立即在-80摄氏度下保存。在使用抑制剂预处理并用AMP底物孵育后，使用0.2微米注射器滤器将上清液过滤至新的1.5毫升微量离心管中。过滤时使用1毫升注射器。

如果高效液相色谱系统配备了自动进样器，请准备用于高效液相色谱的玻璃小瓶，并使用100微升的微型插入管以处理少量样品。用微量移液器或玻璃巴斯德吸管将至少100微升的样品转移至玻璃小瓶中。注意转移过程中避免产生气泡，并用螺口盖密封小瓶。样品现可进行反相高效液相色谱分析。

点击“运行样品”按钮，然后从文件菜单中选择“新建样品集方法”。选择“空白”选项，并指明自动进样器中的小瓶编号、样品名称以及50微升的进样体积。对于后续的所有空白样品和样品运行，选择文本方案中描述的“平衡色谱柱方法”和“运行样品方法”。随后，先注入50微升无血清培养基的空白样品，然后依次注入每个样品。

为确定每个样品中嘌呤的浓度，需通过获取文中所述保留时间下的峰面积，对AMP、腺苷和肌苷进行定量。选择“处理”按钮，随后点击“积分”选项。手动选择每个单一峰的起始点和终点，以获得峰面积测量值。该操作通过在峰的起始点与终点之间划线来完成。

按照文本方案中的描述，计算慢性淋