Name: 海洋微生物的趋化反应的微观尺度的营养层 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 38 s
Description: 学习利用微流控通道技术研究海洋微生物的趋化觅食行为，观察细菌在剪切流中的游动模式。该方法有助于深入理解海洋生态系统中营养循环与微生物动态。

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我们感谢麻省理工学院微系统技术实验室允许我们在其洁净室设施中拍摄本视频的部分内容。

准备
1. 创建一个掩膜&nbsp;
<blockquote>
使用 CAD 软件设计用于在透明胶片上进行高分辨率打印的通道。这将作为“掩模”。
</blockquote>
在洁净室中：
2. 清洁并烘烤晶圆
首先用丙酮冲洗晶圆，然后迅速用甲醇冲洗，接着用异丙醇冲洗。最后用氮气吹干晶圆。
将晶圆放入烤箱中（130°C）烘烤5分钟。
3. 涂覆晶圆
将晶圆置于旋涂机的中心位置。从试剂瓶中将光刻胶（SU-8）滴加到晶圆表面。让 SU-8 自然流动并松弛约 10 秒。启动旋涂仪，用 5 秒时间将转速从 0 加速至 500 转/分钟；保持 500 转/分钟 10 秒；再用 10 秒时间加速至最终转速，并在最终转速下维持 30 秒。最终转速取决于目标涂层厚度及所使用的 SU-8 型号。详细参数可参考 <a href="http://www.microchem.com/">http://www.microchem.com/</a>
4. 软烘
涂覆晶圆后，先在65°C下烘烤，然后在95°C下烘烤。烘烤时间根据目标厚度和所用光刻胶类型而定。随后，让晶圆在室温下静置至少5分钟。
5. 暴露
将掩模置于晶圆顶部，并根据SU-8手册中推荐的时间用紫外光照射晶圆。
6. 曝光后烘烤
按照SU-8说明书的指示，先将晶圆在65°C下烘烤，然后在95°C下烘烤。
7. 显影晶圆以获得“母版”（模具）
准备一个盛有显影剂（PMMA）的烧杯。将晶圆浸入烧杯中，同时非常轻柔地晃动烧杯，直至光刻胶未曝光部分被完全洗去。
在我们的实验室中：
8. 准备聚二甲基硅氧烷（PDMS）并将其倒入晶圆上
将PDMS与其固化剂按10:1的比例混合到杯中。充分搅拌使其均匀混合：此过程会产生大量气泡，使混合物呈现不透明状。将混合物倒在“母模”上。
9. 在真空室中去除气泡
为去除气泡，将覆盖有母模和PDMS混合物的样品放入真空室，直至所有气泡完全消失。
10. 烘箱烘烤
           在65°C的烘箱中至少烘烤12小时，以固化PDMS。
11. 打孔
将PDMS从模具上剥离，并为通道的入口和出口打孔。
在洁净室中（未显示）
12. 等离子体键合
将PDMS层和玻璃载玻片均用氧气等离子体处理1分钟后，通道即与玻璃载玻片键合。
实验：
实验 #1：研究海洋微生物对微尺度营养层的趋化反应
1）设置实验
<ol>
<li>将生物体和底物加入玻璃注射器中</li>
<li>将微流控通道放置在显微镜载物台上，并将管路连接至相应的入口和出口</li>
<li>将管路连接至废液储液池。确保管路完全浸没在废液储液池的液体中，以避免压力波动</li>
<li>将注射器安装到注射泵上，并连接至阀门和管路</li>
<li>设置显微镜：光照条件、放大倍数等</li>
<li>聚焦到通道中的合适位置</li>
<li>使用装有人工海水的大注射器去除通道中的气泡</li>
<li>在注射泵上设定适当的流速。本实验中为 2 ml/min，对应通道内平均流速为 220 µm s-1</li>
</ol>
2）进行实验
<ol>
<li>启动注射泵，以在通道内建立营养梯度</li>
<li>当流动稳定且营养带形成后，停止注射泵的流动，并从此时刻开始记录时间</li>
<li>营养带开始在横向扩散</li>
<li>以固定时间间隔使用图像分析软件记录一系列帧，生成“视频”</li>
<li>通过计算两个连续帧之间的时间差图像&nbsp;&nbsp;，区分游动的生物体，使得&nbsp;仅运动的物体被可视化，从而能够将运动细胞与静止颗粒及&nbsp;背景噪声区分开来</li>
<li>拍摄视频，以相对于营养斑块的位置确定通道内细胞的位置</li>
<li>以固定时间间隔录制10-20分钟的视频，用于分析生物体的位置和游动模式</li>
<li>通过使用图像分析软件将不同帧中生物体的位置叠加（为每个像素分配在视频持续时间内该像素记录到的最大光强度），我们可以&nbsp;获得游动细胞的轨迹信息&nbsp; </li>
</ol>
实验 #2：研究涡流中剪切力对海洋细菌游动的影响
<ol>
<li>通过使用不同的通道几何结构，我们可以观察细菌在不同剪切速率的涡流中游动的行为</li>
</ol>

<ol><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).</li>
<li>Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+explicit+simulations+of+a+microbial+food+web.+%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Spatially explicit simulations of a microbial food web. </a> Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+plankton+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282, 2254-2256 (1998).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).</li>
<li>Marcos,, Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+in+vortices%3A+a+microfluidic+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Microorganisms in vortices: a microfluidic setup.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).</li>
<li>Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+topology+on+bacterial+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of topology on bacterial social interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
</ol>

深入了解海洋微生物如何与其局部的化学和物理环境相互作用，对于更全面、更精确地认识浮游微生物在海洋营养循环和碳循环中的作用至关重要（Azam 和 Malfatti，2007）。然而，由于许多重要的微生物相互作用发生在极小的尺度上（&lt; 毫米级），技术上的限制一直阻碍了对海洋中游动微生物所经历的复杂生物-物理-化学异质环境中微生物行为的细致研究。近年来微流控技术的进步（Whitesides 等，2001）使得能够在复杂的微生境中对微生物生态进行详细分析（Mao 等，2003；Park 等，2003；Keymer 等，2006；Marcos 和 Stocker，2006）。本文所描述的微流控装置使我们能够在单细胞水平上研究海洋微生物对扩散性营养斑块的趋化响应（Blackburn 等，1997，1998），以及微生物在湍流剪切环境中的游动行为。

用于制造微流控通道的软光刻 fabrication 工艺可在通道结构内实现复杂的细节，从而精确控制通道内的流体流动和浓度梯度。该 fabrication 技术提供的灵活性使得能够制备不同尺寸的通道，用于开展对比研究。此处应用的图像分析系统...

<table><tbody><tr><td>PDMS，Sylgard 184</td><td>硅弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>http://www.ellsworth.com/sylgard.html</td></tr><tr><td>SU8-2100</td><td>光刻胶</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>www.microchem.com</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E 倒置显微镜</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEEK 管（内径 0.762 mm，外径 1.59 mm）</td><td>工具</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>www.upchurch.com</td></tr><tr><td>注射器（鲁尔锁扣式针头）</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>接头部件 P-704-01</td><td>工具</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>用于将管路连接至鲁尔锁扣式注射器</td></tr><tr><td>注射泵（PHD 2000 可编程型）</td><td>设备</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机（PCO 1600）</td><td>设备</td><td>Cook</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

海洋微生物对微尺度营养层的趋化响应

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

浮游微生物利用微尺度资源斑块的程度，将对海洋营养动力学和生物地球化学通量产生重要影响。然而，为了利用海洋中的营养斑块，运动型微生物必须克服分子扩散和湍流剪切等物理力的影响，这些物理力会限制斑块的可获得性以及细菌定位斑块的能力。直到最近，方法学上的局限性一直阻碍了对微生物在斑块状生境及真实小尺度流动条件下行为的直接观察。因此，目前我们关于海洋微生物行为的大部分知识主要来源于理论预测。为了获取有关海洋微生物觅食行为的新信息，我们应用软光刻微加工技术开发了两种微流控装置，用于构建（i）具有与海洋过程相关的尺寸和扩散特性的微尺度营养斑块，以及（ii）剪切速率与海洋中预期值相当的微尺度涡旋。这些微流控装置首次实现了对微生物在异质且动态的海洋微环境中游泳行为和趋化行为的直接观测。结合使用落射荧光显微镜和相差显微镜，可在观察微生物群体水平聚集反应以及个体微生物游泳行为的同时，直接测定营养斑块的物理尺寸和扩散特性。实验结果表明，某些种类的浮游植物、异养细菌和吞噬型原生生物能够在极短时间内有效定位并利用扩散中的微尺度资源斑块。我们还发现，在中等剪切速率范围内，海洋细菌能够抵抗流体流动，自主地在其环境中游动；但当剪切强度超过某一阈值时，细菌会被迫沿剪切流方向排列，其自主游泳能力显著下降，难以摆脱流场干扰。微流控技术为研究水生微生物生态学提供了一种新颖且低成本的方法，因其能够在微尺度上精确模拟真实的流场和底物浓度梯度，特别适用于在最小相互作用尺度上对微生物行为进行研究。因此，我们认为微流控技术是深入理解海洋微生物生态的重要工具。

本文描述了微流控通道的制备及其在实验中的应用，用于研究海洋微生物在斑块状营养环境中的趋化觅食行为，以及细菌在剪切流中的游动行为。

浮游微生物在多大程度上能够利用微尺度资源斑块，将对海洋营养动力学产生重要影响，并……

大家好，我叫Marcos。我在麻省理工学院土木与环境工程系与Roman Stalker教授合作，今天我将向大家演示如何利用自拍摄影技术制作微通道。首先，我们需要设计一个掩模。这就是掩膜，基本上是我们想要制作的微通道的最终设计。这是一个进样器的设计，因此我们可以形成一层很薄的营养层，将微生物放置在周围并观察它们的趋化性。此外，还有一个侧腔通道，用于在腔内产生微涡流，稍后在获得掩膜后会有视频展示这一现象。接下来，我们将晶圆带入洁净室，并将其放入培养皿中。现在，我们要前往洁净室了。好的，我们在完成掩模的打印并做好准备后，现在进入洁净室进行实际的微加工操作。接下来，我将取一片刚购买的洁净晶圆，并使用以下三种溶剂确保其表面格外清洁。第一步是用丙酮清洗，然后立即用甲醇清洗。最后一步是使用异丙醇。我们正在处理晶圆的光亮面，该表面已为镀膜做好准备。现在我将使用氮气将其吹干。干燥晶圆后，现在将晶圆放入约130摄氏度的烘箱中，烘烤5到10分钟。在此期间，当等待晶圆烘烤时，我们可以准备两个加热板，一个设为1765摄氏度，另一个设为195摄氏度。烘烤5分钟后，将晶圆从烘箱中取出，置于室温下静置约5分钟。然后我们就可以进行旋涂了。在倾倒光刻胶之前，需要确保其表面没有灰尘颗粒，我们使用氮气对晶圆表面进行吹扫。吹扫时应从中心向外周进行。现在我将把光刻胶倒在晶圆表面。我们大约倒入三毫升。倾倒时尽量让瓶口贴近晶圆，以避免在光刻胶涂布过程中产生气泡。现在，让光刻胶在晶圆上静置约一分钟，然后再开始旋转。正如我提到的，我将制备一层厚度为100微米的涂层。因此，我们将总旋转时间设定为55秒，现在可以开始旋转了。首先，我们将转速在五秒内从零逐渐增加到 500 RPM，并保持旋转约 10 秒，以便观察光刻胶是否已均匀涂覆整个硅片；随后将转速提升至 3000 RPM，持续约七秒，并继续旋转 30 秒。在完成硅片上的光刻胶涂覆后，我将硅片放置在加热板上，先在 65 摄氏度下预烘五分钟，再在 95 摄氏度下预烘 20 分钟。当 95 摄氏度的预烘步骤完成后，我们将其冷却至室温；但在冷却至室温之前，需先在 65 摄氏度下冷却约两到三分钟，以避免温度急剧下降。然后将其置于室温下冷却约五分钟。接下来，我将用紫外光照射它，使被照射的部分固化，而未被照射的部分稍后会被洗去。这一步骤中我们会使用掩膜，如您所见，该掩膜包含两个部分：一部分是透明的，另一部分则是完全不透明或呈黑色，在此设置中如此。因此，我将把这块掩模放在已涂覆的晶圆顶部。从打印公司获得的掩模有两面，其中一面是用墨水打印的那面。这是需要与晶圆接触的区域。现在我将通过掩模用紫外光照射晶圆。出于安全考虑，我将佩戴这副护目镜。曝光时间的长短取决于所使用的 SUA 以及您希望达到的厚度。曝光完成后，我将晶圆放置在 65 摄氏度的热板上，再次烘烤五分钟，然后在 95 摄

chemotactic-response-marine-micro-organisms-to-micro-scale-nutrient

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

海洋微生物的趋化反应的微观尺度的营养层

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本方案描述了一种用于在化学效应物的稳定浓度梯度中研究细菌趋化性的微流控装置的开发。...

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本文描述了评估细胞对急性机械刺激反应的方法。在基于显微镜的检测中，我们通过短暂的剪切流刺激后，观察荧光标记的生物传感器的定位变化。此外，我们还通过生物化学方法检测多种目标蛋白在急性机械刺激下的激活情况。...

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Jared Leadbetter 带我们进行了一次自然观察之旅，探索白蚁后肠中栖息的生命多样性——这个微环境包含了地球上其他任何地方都找不到的 250 种不同物种。Jared...

共生的层次——可视化白蚁后肠微生物群落

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利用环境转录组学分析海洋微生物群落的基因表达

学习利用微流控通道技术研究海洋微生物的趋化觅食行为，观察细菌在剪切流中的游动模式。该方法有助于深入理解海洋生态系统中营养循环与微生物动态。

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