海洋微生物对微尺度营养层的趋化响应

大家好，我叫Marcos。我在麻省理工学院土木与环境工程系与Roman Stalker教授合作，今天我将向大家演示如何利用自拍摄影技术制作微通道。首先，我们需要设计一个掩模。

这就是掩膜，基本上是我们想要制作的微通道的最终设计。这是一个进样器的设计，因此我们可以形成一层很薄的营养层，将微生物放置在周围并观察它们的趋化性。此外，还有一个侧腔通道，用于在腔内产生微涡流，稍后在获得掩膜后会有视频展示这一现象。接下来，我们将晶圆带入洁净室，并将其放入培养皿中。现在，我们要前往洁净室了。

好的，我们在完成掩模的打印并做好准备后，现在进入洁净室进行实际的微加工操作。接下来，我将取一片刚购买的洁净晶圆，并使用以下三种溶剂确保其表面格外清洁。第一步是用丙酮清洗，然后立即用甲醇清洗。

最后一步是使用异丙醇。我们正在处理晶圆的光亮面，该表面已为镀膜做好准备。现在我将使用氮气将其吹干。

干燥晶圆后，现在将晶圆放入约130摄氏度的烘箱中，烘烤5到10分钟。在此期间，当等待晶圆烘烤时，我们可以准备两个加热板，一个设为1765摄氏度，另一个设为195摄氏度。烘烤5分钟后，将晶圆从烘箱中取出，置于室温下静置约5分钟。

然后我们就可以进行旋涂了。在倾倒光刻胶之前，需要确保其表面没有灰尘颗粒，我们使用氮气对晶圆表面进行吹扫。吹扫时应从中心向外周进行。

现在我将把光刻胶倒在晶圆表面。我们大约倒入三毫升。倾倒时尽量让瓶口贴近晶圆，以避免在光刻胶涂布过程中产生气泡。

现在，让光刻胶在晶圆上静置约一分钟，然后再开始旋转。正如我提到的，我将制备一层厚度为100微米的涂层。因此，我们将总旋转时间设定为55秒，现在可以开始旋转了。

首先，我们将转速在五秒内从零逐渐增加到 500 RPM，并保持旋转约 10 秒，以便观察光刻胶是否已均匀涂覆整个硅片；随后将转速提升至 3000 RPM，持续约七秒，并继续旋转 30 秒。在完成硅片上的光刻胶涂覆后，我将硅片放置在加热板上，先在 65 摄氏度下预烘五分钟，再在 95 摄氏度下预烘 20 分钟。当 95 摄氏度的预烘步骤完成后，我们将其冷却至室温；但在冷却至室温之前，需先在 65 摄氏度下冷却约两到三分钟，以避免温度急剧下降。

然后将其置于室温下冷却约五分钟。接下来，我将用紫外光照射它，使被照射的部分固化，而未被照射的部分稍后会被洗去。这一步骤中我们会使用掩膜，如您所见，该掩膜包含两个部分：一部分是透明的，另一部分则是完全不透明或呈黑色，在此设置中如此。

因此，我将把这块掩模放在已涂覆的晶圆顶部。从打印公司获得的掩模有两面，其中一面是用墨水打印的那面。

这是需要与晶圆接触的区域。现在我将通过掩模用紫外光照射晶圆。出于安全考虑，我将佩戴这副护目镜。

曝光时间的长短取决于所使用的 SUA 以及您希望达到的厚度。曝光完成后，我将晶圆放置在 65 摄氏度的热板上，再次烘烤五分钟，然后在 95 摄氏度下烘烤 20 分钟。需要提醒的是，烘烤时间会因所需的厚度以及所使用的方法不同而有所变化。

在此之后，我们将对晶圆进行显影。所谓显影，是指去除光刻胶中不需要的部分，使得只有曝光区域保留在晶圆上。为了实现晶圆的显影并洗去光刻胶中不需要的部分，我们使用显影液。

在此情况下，我使用正戊酸乙酯作为显影剂，将这种溶剂倒入烧杯中，然后放入晶圆，使其完全浸入烧杯中约10分钟。需要注意的是，显影时间会根据薄膜厚度和所用溶剂的不同而有所变化。10分钟后，可以看到晶圆上仅保留了所需通道的图案，其余不需要的部分已被洗去，最后只需用溶剂冲洗一下即可。

我们使用相同的溶剂，即新鲜的溶剂，以及相同的聚醋酸乙烯酯，将其直接滴加到晶圆表面进行冲洗。最后，为了洗去残留的溶剂，我们使用异丙醇进行简单冲洗。然后，现在我们用氮气吹干样品。

现在，您已获得表面具有理想图案的洁净晶圆，我们称之为“母版”。接下来，我们将返回实验室，在其上浇注聚二甲基硅氧烷（PDMS），并继续后续实验步骤。

现在我们从洁净室回来了，拿到了主模板，这个主模板就是用于复制微结构的模具。接下来我们要做的是浇注PDMS——一种聚合物材料，它将经过固化。正如您所见，当我们将这种聚合物浇注到模具表面时，聚合物表面会形成相应的沟槽结构；最终，当我们将其与玻璃片键合后，该聚合物本身便形成了微流控通道。

现在我们将准备PDMS。这是PDMS，即聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS），这是固化剂。

我将把这种固化剂倒入这个杯子中，再将PDMS倒入同一个杯子中，并按1:10的比例进行混合。因此，我们通常会使用搅拌棒充分搅拌，使其均匀混合。在搅拌过程中会产生大量气泡，这些气泡可以作为判断是否充分搅拌的参考依据。

现在，将PDMS与固化剂混合后，我们准备将此混合物浇注到作为模具的硅片上。为了确保在浇注过程中硅片不会移动，我们用胶带将硅片固定住。在将PDMS混合物浇注到硅片之前，应尽量清除可能落在硅片表面的灰尘，使其尽可能洁净。

因此我们打开压缩机来吹扫晶圆。好的，可以看到PDMS中有许多气泡。接下来，我们将把样品放入真空腔室中以去除这些气泡。

因此，抽真空大约需要30分钟以去除所有气泡。完成气泡去除后，将样品取出并放入65 °C的烘箱中，至少烘烤12小时。12小时后，晶圆即可准备进行切割。

我将使用这把刀切割PDMS，将PDMS从晶圆上取下，然后使用打孔器在进样口和出样口位置打孔。切割时，应将刀下压至接触到晶圆为止，但不要施加过大压力，以免损坏晶圆，沿微通道周围完整切割一圈。现在将其剥离。

现在你可以看到，这个通道就是晶圆上的图案。因此可以看出它们是相同的。而这个图案已经被刻蚀到这种聚合物PDMS上。

当它们与玻璃片结合后，就会形成我们实验所需的通道。下一步非常关键，即需要记住打孔，以便在将孔打在PDMS的微通道上后，能够插入进样口和出样口。因此，我们使用透明胶带贴在通道一侧，也就是有凹槽的位置，并将其粘住。

我们用透明胶带粘贴这个通道的原因是为了去除所有灰尘颗粒。下一步是等离子体键合。在进行等离子体键合之前，我们先要到另一个实验室操作，此时需移除胶带，暴露出需要键合的表面，即该表面与玻璃载片的表面，然后将二者暴露于氧气等离子体中，随后将它们贴合在一起，即可实现键合。

大家好，我叫Justin Seymour，是麻省理工学院Roman Stocker实验室的一名博士后研究员。我的研究聚焦于微生物生态学，更具体地说，是研究海洋微生物如何在海洋中找到食物富集区域。我们采用微流控技术来观察这类行为模式。

因此，我们将使用 Marcus 之前演示制作的通道，在完成等离子体键合后，即可在微流控实验中自由使用。在进行本实验之前，我们需要先准备好实验中将要使用的基底材料。

在今天的实验中，我们将研究海洋浮游植物 *donella tur electro* 如何寻找微尺度的食物斑块。在本实验中，食物为铵离子，我们将为其提供浓度为 100 µM 的铵。通过向所提供的营养物质中添加荧光染料，我们能够在实验中直观地观察到这些食物斑块。

因此我们使用荧光素染料。在这里，我将荧光素加入铵盐中，终浓度为100 µM，铵盐作为营养物质。随后我们可在荧光显微镜下观察该营养物质，从而研究营养物质斑块的扩散过程，并观察生物体对该营养斑块的响应情况。

在微流控实验中，我们使用玻璃注射器。因此，首先要将底物和生物体加入到即将使用的注射器中。下一步是将管路插入微流控装置中。

我们在显微镜载物台上进行此操作。将微流控通道放置在显微镜载物台上，然后将管路插入入口和出口。接着插入废液储液池，并确保储液池中液体填充至一半高度，使废液储液池中的管路完全浸没在液体中。

这使我们能够在通道内维持恒定的压力。然后将注射器连接到为微流控通道输送液体的管路中，该通道内含有生物体，此处为多内拉（donella）、莱克托（lector）以及营养底物，此处为铵盐（ammonium）。随后我们设置好显微镜，在开始实验前将微流控通道调整至合适的观察位置。

当通道到达指定位置后，我们随即切换至摄像头视图，即可在计算机上观察到该通道。此时可通过调焦进行更精细的调整，并观察用于注入营养物质的注射器。该注射器由一个直径为100微米的金属包被针尖构成，集成于微流控通道内部。

我们可以通过注入营养物质来形成营养梯度。在开始实验之前，需要去除可能进入微流控系统的气泡。具体操作是使用一支装有人工海水的注射器，通过阀门将其连接到微流控通道上来完成排气。

然后推动此注射器，以去除通道中的气泡。我们可以通过两种方式去除气泡：一种是利用注射器产生的压力将气泡从出口推出；另一种是将气泡强行通过PDMS材料的壁面排出，因为PDMS材料对气体具有通透性。一旦气泡被清除且实验准备就绪，我们便使用注射泵设定适当的注入流速和通道内物料的流速。

在此情况下，我们采用每分钟 2 微升的流速，相当于微流控通道内的流速为每秒 266 微米。设定合适的流速后，即可通过启动流动开始实验，从而形成一条狭窄的营养物流带。通过向营养液中添加荧光素染料，并在 APF 荧光显微镜下观察，我们可以可视化营养液从注入点进入通道时的情况。随后，通过停止微流控通道中的流动，观察营养物流带从原始位置向侧向扩散的过程，即可研究营养斑块的动态变化。

随后，我们切换至相差显微镜，以观察生物体在通道内的游动情况，并分析它们相对于营养斑块的位置。我们以每秒10帧的帧率连续采集图像序列，生成一段视频，从而可视化这些生物体的运动。通过计算相邻两帧之间的时间差（即用前一帧减去后一帧），仅保留移动的物体，即可清晰地观察到游动中的生物体。

因此，我们可以从图像中去除背景噪声。随后，在初始营养斑块释放后，以规律的时间间隔连续录制10到20分钟的视频。通过使用图像分析软件，将序列中一帧画面的生物位置叠加到另一帧上，我们能够观察这些生物位置的变化，从而获取其游泳轨迹的信息，并进一步分析其游泳的统计特征，包括速度和方向变化等详细信息。

这些实验使我们首次能够直接观察海洋微生物如何寻找并利用微尺度的营养斑块。这可能对海洋中的营养级动态和营养循环具有重要意义。正如贾斯汀所提到的，海洋微生物特别是细菌与海洋中食物的相互作用，可能对生物地球化学循环产生多种影响。

然而，海洋环境实际上非常复杂，其中存在许多尚未被充分研究的流动条件，例如由风或海面产生的湍流。在微生物所处的尺度上，它们所感知和经历的并非大规模的湍流，而是剪切力以及湍流中最小尺度的残留涡旋，后者被称为科尔莫戈罗夫微涡（Kolmogorov eddy）。我们在此试图探究的问题是：这类微涡对微生物的趋进行为会产生怎样的影响。

为了实现这一点，我们将利用之前展示给您的这个质量块来制作另一个通道。在中心位置有一个空腔。让我将其画出来，以放大示意图。

因此，这就是通道的形态：我们看到的是从顶部观察的视图，流体从左侧注入并向右侧流动，由于剪切作用，在这个腔体内形成了一处回流区域。该腔体代表了一个阿迪斯（graph Addis）结构。我们可以直接采用贾斯汀之前已经介绍过的相同装置设置。当注射泵关闭且未开启任何流动时，你可以看到细菌在这个腔体内几乎随机而自由地游动。

并且没有优先取向。您所看到的影片是时间差影像，这正是 Justin 所使用的完全相同的技术。因此，当流动非常快时，正如您所见，细菌正被涡流带走。

细菌自身的运动轨迹遵循涡流的流线。而真正更有趣的是，当我们启动注射泵时，流速并不太快。

这种流动速度并不太快，细菌本应能够抵抗，但在此情况下，你仍然可以清楚地看到这段视频中存在类似涡旋的结构。因此，从本实验中我们了解到，在强湍流存在的情况下，细菌完全受流动支配，无法对抗流体的运动。

然而，在轻度湍流区域，它们仍能按照自身意愿游动。