类器官电穿孔：一种将质粒DNA转染入胃肠道类器官的方法

— 类器官是由组织特异性干细胞衍生而来的微小三维细胞培养物。它们基因组稳定，但可通过转染进行遗传修饰，因此非常适合用于遗传学研究。进行转染时，将类器官接种于含特定培养基的多孔培养板中，并孵育所需时间。随后，向培养板中加入消化混合液以促进类器官细胞的解离。将混合液转移至离心管中并离心。将类器官沉淀重悬于含有荧光标记质粒DNA的电穿孔缓冲液中。该缓冲液可稳定细胞，并防止因电刺激导致的细胞死亡。

将混合物转移至比色皿中，并对细胞进行电穿孔。细胞膜上的电脉冲会形成瞬时孔隙，从而促进质粒DNA进入细胞。电穿孔后，立即向细胞悬液中加入培养基，并将混合物转移至离心管中。随后离心细胞，将沉淀重悬于基底膜基质中，并转移至多孔板中进行聚合。将多孔板置于荧光显微镜下，观察细胞中的荧光信号，以确认转染效率。在以下实验方案中，我们将通过电穿孔法对胃肠道类器官进行转染。

— 首先将48孔板在37摄氏度预热，用于电转染后接种；随后根据文稿说明配制基础培养基和类器官培养特异性培养基。每份电转染样品在48孔板中培养五个孔的类器官。每孔准备含10微摩尔Y27632的230微升解离试剂。在显微镜下观察类器官。从孔中移除培养基，并在已配制的解离试剂中通过机械方式解离类器官。将每份电转染样品的五个孔合并至一个15毫升离心管中。

将离心管中的内容物涡旋混匀，在37摄氏度孵育5至15分钟，直至形成由10至15个细胞组成的细胞团簇，并在显微镜下观察解离情况。加入最多10毫升不含抗生素的基础培养基以终止消化反应。在450 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用4毫升电穿孔缓冲液将细胞洗涤两次，每次洗涤后离心并弃去上清液。洗涤结束后，将类器官沉淀重悬于含有30微克质粒DNA的100微升电穿孔缓冲液中。

将完整的DNA-类器官混合物加入电穿孔比色皿中。注意避免产生气泡。按照文稿中所述设置电穿孔参数，并用手指轻弹比色皿以轻轻混匀细胞。将比色皿放入比色皿室，按下电穿孔仪上的阻抗按钮以记录阻抗值。按下“开始”按钮启动电穿孔程序，并监控显示的电流、电压和能量数值。

电穿孔后，立即向细胞中加入500微升不含抗生素的培养基，并通过上下吹打混匀。将样品转移至新的15毫升离心管中，用基础培养基冲洗电穿孔杯以收集残留的细胞，然后在室温下孵育40分钟。在450 × g下离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于100微升基底膜基质中，并在预热的48孔板中接种20微升的液滴。

将培养板在37摄氏度孵育10分钟以促进聚合，每孔加入250微升含有Y27632和CHIR-99021的培养基。为确定转染效率，在转染后24至48小时于显微镜下观察转染对照组的荧光情况。