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癌症研究
0 次观看 • 5:00 分钟 • April 30th, 2023
— 活化的T细胞迁移至胰腺肿瘤微环境，在此释放干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子，从而介导有效的抗肿瘤免疫反应。由于细胞因子会迅速从T细胞中释放，其胞内水平可能无法被检测到。因此，需要对T细胞进行刺激，以提高基础细胞因子的产生水平，从而研究其在肿瘤中的治疗作用。
首先从小鼠的胰腺中获取肿瘤细胞悬液。然后，用细胞因子刺激剂混合物处理细胞悬液中的T细胞，并将混合物在所需时间内进行孵育。该混合物可促进钙离子从内质网释放到细胞质中。高水平的钙离子进而激活某些细胞核转录因子，导致T细胞中细胞因子的产生增加。
接下来，用蛋白质转运抑制剂混合物处理细胞，并将试管进行孵育。该混合物可阻断细胞因子从内质网向高尔基复合体的转运，从而导致细胞因子在细胞内积聚。最后，使用适当的细胞内标志物对细胞进行染色，以用于流式细胞术分析。在以下实验方案中，我们将进行T细胞刺激，以提高细胞内细胞因子的浓度。
— 首先，使用镊子将肿瘤转移至培养皿中。将5毫升消化液储存于50毫升离心管中，并置于冰上，以防止酶活性提前启动。取少量该溶液覆盖培养皿中的肿瘤组织。使用无菌手术刀和镊子将肿瘤切成小块，每块长度约小于3毫米。用刮勺将肿瘤碎片刮入离心管中，并轻轻颠倒混匀管子，直至所有组织块均浸没于消化液中。将离心管置于摇床上，在37摄氏度下振荡消化20分钟。确保所有肿瘤组织块均完全浸没，且未粘附在管壁边缘。
消化步骤完成后，立即将离心管置于冰上以减缓酶活性。加入EDTA，使其终浓度达到20毫摩尔，并短暂涡旋混匀，以进一步抑制酶活性。打开管盖，用新鲜的RPMI培养基将管盖内壁的肿瘤消化物冲洗至管中。随后，准备一个70微米的细胞筛，将其置于冰上盛有50毫升开口离心管的管口。用培养基预先润湿滤膜。用25毫升或更大规格的移液管重悬消化后的细胞，并冲洗管壁。移液管较宽的开口有助于黏稠的消化液顺利通过。
使用25毫升移液管将全部消化物转移至滤筛上。利用1毫升注射器的推杆在滤膜上方反复碾压肿瘤组织。持续用RPMI培养基冲洗细胞使其通过滤筛，冲洗时需施加足够的力度以推动细胞通过。继续冲洗直至所有细胞均通过滤筛。将离心管在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。
轻轻重悬细胞沉淀于完全RPMI培养基中，并立即通过另一个滤器过滤，以去除任何无法充分重悬的细胞外基质或大的细胞团块。如无需刺激处理，可直接对分离的细胞进行流式细胞术染色分析，或将其重悬于含10% DMSO的FBS冻存液中，于-80摄氏度保存。
进行刺激时，首先计数细胞。将细胞用完全培养基稀释，调整浓度至每100微升含2×10⁶个细胞。在96孔U型底培养板的每个孔中加入100微升细胞悬液。每孔加入含PMA和离子霉素2倍浓度（2X）的完全培养基100微升。将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育1小时。随后，加入20微升10倍浓度（10X）的布雷菲德林A（Brefeldin-A）和莫能菌素（Monensin）混合液，并补足完全培养基，使终浓度分别为1.06 µmol/L和2.0 µmol/L。将培养板再次放回培养箱中继续孵育4小时。