通过胶原酶灌注法分离胰岛：一种分离胰岛细胞的酶消化方法

— 胰腺中的胰岛细胞可产生参与内分泌功能的关键激素。分离胰岛时，首先固定一只已处死的小鼠，并通过手术暴露其腹腔。拨开肝脏和肠道，找到胆总管并进行夹闭。确定肝胰壶腹（Vater壶腹），即胰管与胆总管汇合后形成的导管结构。

接下来，将胶原酶溶液注入胆总管。来自导管的反流成功地使胰腺膨胀，促进胶原酶对胰腺组织的解离。将胰腺切除并放入含有更多胶原酶溶液的试管中。机械剪切组织，并进行孵育以促进胶原酶对组织的消化。

获得均一悬液后，加入含有能抑制胶原酶活性蛋白的溶液以终止酶消化反应。离心以收集组织沉淀。将沉淀重悬于适当的密度梯度介质中，在其上层覆盖合适的缓冲液，然后离心以形成密度梯度层。

从密度梯度介质与缓冲液之间形成的界面收集胰岛。最后，挑选健康的胰岛用于培养。在以下方案中，我们将演示通过注射胶原酶并结合密度梯度离心法分离小鼠胰腺胰岛的方法。

— 首先将小鼠四肢固定于仰卧位，并用70%乙醇喷洒其体表。使用盖玻片镊子和弯头手术剪，在腹部皮肤上做一个约3厘米长的横向切口，拉开皮肤以暴露腹壁。在腹膜上做3至4厘米长的纵向切口，充分暴露胰腺，并将小鼠置于解剖显微镜下。

将肝叶向上推，以暴露呈淡粉色管状的胆管，同时轻柔地将右腰部和髂区的肠管移至腹腔右侧，以暴露胆管和肝动脉。使用Schwartz显微止血夹，尽可能靠近肝脏处小心夹闭胆总管，并辨认法特壶腹，其位于十二指肠乳头，由胰管与胆总管汇合而成。

使用显微 Adson 镊子牵拉胆总管使其绷紧，将连接在含有 3 毫升新鲜配制的胶原酶 P 溶液的 3 毫升注射器上的 30 号半英寸针头插入壶腹（Vater 壶腹），并将针头平行于血管方向推入导管，深度约为血管长度的四分之一。针头就位后，用显微 Adson 镊子固定针头，并缓慢而稳定地将 3 毫升胶原酶 P 溶液注入导管中。若胰腺的头部、颈部、体部和尾部区域均充分膨胀，则视为注射成功。

- 正确进入壶腹部并插管胆总管对于成功获取消化产物至关重要。刺破导管壁会降低分离效果。

— 使用弯头显微Adson镊子，从脾脏开始，沿胃部及十二指肠方向，小心地将膨胀的胰腺拉出。随后将胰腺置于一个50毫升的消化管中，管内含有3毫升冰冻的胶原酶P溶液。为收获胰岛，首先使用精细手术剪将胰腺剪切3至5秒，然后将消化管放入37摄氏度水浴中，在每分钟100至120转的振荡条件下孵育12至13分钟。

孵育结束后，轻轻振荡试管约30秒，以破碎组织，直至溶液呈均一状态，可通过观察到细小的、类似沙粒状的胰腺组织颗粒来确认。一旦组织消化完成，立即将试管置于冰上，并加入40毫升预冷的终止液以终止酶反应。轻轻吹打重悬沉淀后，使用水平转子离心机离心收集消化后的组织，随后每次用20毫升新鲜终止液洗涤，共离心两次。

最后一次洗涤后，将沉淀重悬于 40 毫升冰浴的 HBSS 中，再进行三次洗涤；最后一次洗涤后，将沉淀重悬于 5 毫升室温密度梯度溶液中。将离心管轻轻低速涡旋振荡，直至溶液均匀，然后向管中加入另外 5 毫升室温密度梯度溶液。接着使用 10 毫升移液器，以逐滴方式缓慢、轻柔地向管中加入 10 毫升室温 HBSS，以形成梯度，并使用水平转子离心机通过密度梯度分离法分离细胞群体。

离心结束后，使用已用预冷的HBSS润洗过的10毫升移液管，从密度梯度与HBSS之间的界面处收集5至10毫升的胰岛层。将胰岛转移至一个新的含有20毫升新鲜冰冻HBSS的50毫升离心管中，并使用摆动桶离心机通过离心收集细胞。小心吸除上清液，仅保留最后3毫升，避免扰动沉淀物；随后每次用20毫升新鲜HBSS对胰岛至少再清洗三次。

最后一次洗涤后，将上清液替换为4毫升37摄氏度的RPMI 1640培养基，并轻轻旋转离心管以悬浮沉淀。立即将胰岛倒入一个100毫米的培养皿中，并用5毫升新鲜RPMI 1640培养基冲洗离心管，以收集残留的胰岛，将冲洗液与之前的胰岛合并。

然后使用解剖显微镜和20微升移液器吸头，从培养皿中挑选表面光滑、呈健康球形或椭圆形的金棕色胰岛，转移至含有10毫升完全RPMI 1640培养基的新培养皿中。待所有胰岛收集完毕后，将胰岛置于37°C、5%二氧化碳、湿化空气的无菌培养箱中过夜培养。