三维球状体中的细胞外通量检测：一种测量胰腺肿瘤球状体代谢活性的方法

— 胰腺癌细胞在肿瘤微环境（TME）中与癌症相关成纤维细胞相互作用。这些相互作用可调节癌细胞的代谢活性，并影响癌症的进展。

类球体是能够在体外重现肿瘤微环境（TME）的细胞聚集体。因此，我们可以利用这些类球体通过细胞外通量分析来检测肿瘤代谢功能的变化。该分析通过测定细胞外氧气和质子的浓度，分别反映有氧代谢和糖酵解代谢情况。

首先，取由胰腺癌细胞与胰腺成纤维细胞共培养形成的适当大小的三维球状体。随后，将球状体转移至通量分析板中，并用含有测试药物的传感器盒覆盖。在细胞外通量分析仪中运行检测。

通量分析仪通过气动方式在特定时间点将测试药物从传感器盒注入分析板。细胞在受到测试药物刺激后，会向分析板的微室中释放质子和氧气，传感器探针中的荧光染料可检测这些物质的水平。最后，使用适当的软件分析类球体的功能特性。

在以下实验方案中，我们将演示一种利用细胞外通量分析法测定三维球状体中胰腺肿瘤细胞代谢功能的方法。

代谢检测实验前一天，在提供的工具板中，每孔加入 200 微升检测校准液以润湿探针板，然后将工具板置于湿润的 37 摄氏度无 CO2 培养箱中过夜孵育。

次日早晨，在光学显微镜下观察生长培养板中的类球体，检查其形态及整体均一性。将生长培养板转移至磁力固定驱动器上，小心吸取每孔约120 µL的生长培养基。

用 120 微升预热的培养基轻轻洗涤类球体，重复三次。最后一次洗涤后，再次在显微镜下检查类球体，确认其未被洗脱，然后向每个孔中加入 180 微升温热的培养基。

使用大孔吸头小心吸取一个预先洗涤过的类球体，从细胞防附着培养板中将其轻柔转移至类球体检测板的一个孔中央，让类球体依靠重力自然落入该孔的中心微腔室中。

当所有类球体转移完毕后，将检测板放入无 CO2、37 摄氏度、加湿空气的培养箱中孵育 1 小时。孵育期间，调整传感器微孔板方向，使 A 至 H 行位于左侧，并将加样导板置于微孔板上方，使待加样的孔所对应的字母位于左上角。

如果平板加样均匀，打开分析软件并点击“模板”。双击“空白模板”，然后点击“生成分组”。在“平板图谱”选项卡下，根据实验设计为检测板分配分组，并选择四个角上的孔作为背景孔。

在“仪器方案”选项卡下，勾选校准、平衡和基线测量循环。点击“进样”并为每个进样口定义化合物。将测量循环次数更改为6。查看方案和组摘要，然后保存检测设计模板。

根据检测设计的指引，使用多通道移液器将每种试剂直接加入进样口，同时用手指固定加样导板。所有试剂加样完毕后，移去加样导板，将 cartridge 持于视线水平，目视检查各进样口的加样是否均匀。

将捕获柱和工具板转移至细胞外通量分析仪，并启动预实验校准。校准完成后，将工具板替换为含有预热3D球状体的检测板，并开始检测。检测结束后，将数据导出至相应的数据分析软件中。