研究视网膜色素上皮生理学与病理生理学的实验模型

本实验的总体目标是建立可用于研究的人类胎儿视网膜色素上皮（RPE）细胞培养模型。在人类眼病研究中，组织样本来自捐献者的完整眼球。实验的第一步是切除多余的眼外肌和结缔组织，然后通过移除角膜和晶状体打开眼球。

眼睛经dispa处理并压平后，将RPE单层从脉络膜上剥离下来。分离的RPE细胞接种于培养瓶中，培养数周直至形成融合的单层细胞并产生色素。细胞培养物用于体外功能实验。

成功的体外实验将在临床前试验动物模型中重复进行，以便在更复杂的信号环境中更好地评估视网膜色素上皮（RPE）的反应。本文展示的模型将有助于深入理解RPE的生理机制，并为治疗眼部疾病提供新的治疗干预手段。大家好，我叫Sheldon Miller。

我的实验室位于马里兰州贝塞斯达校区的美国国立卫生研究院下属的国家眼科研究所。大家好，我是来自米勒实验室的Arki。今天我们将向您展示一种制备人胎儿视网膜色素上皮细胞原代培养物的实验方法。

这些细胞将被培养成融合的单层细胞，可用于安装在改良的单室中。我们还将利用这些分离的人视网膜色素上皮（RPE）细胞进行生物化学和遗传学研究。在本实验室中，我们采用该方法建立上皮细胞的原代培养，以研究生理和病理生理过程的功能与调控机制，并建立疾病的临床前动物模型。

我们重点关注位于眼球后部的视网膜色素上皮（RPE），它分隔了神经视网膜与脉络膜的血液供应。该眼球示意图显示了RPE层在眼球后部的位置，紧邻光感受器。插图展示了视网膜的细胞结构，右侧为光感受器，左侧为节细胞。

该上皮组织具有极高的代谢活性。它以昼夜节律持续吞噬感光细胞，并储存、修饰以及向感光细胞转运视觉色素维生素A。在视觉循环过程中，它通过稳态调节作用，维持周围细胞外空间的化学成分和体积稳定。

上皮细胞的一个关键特性是其极性。将蛋白质持续不对称地运输至顶膜和基底外侧膜是一个受调控的过程，使上皮细胞能够介导代谢物、离子和液体从一个细胞外空间向另一个细胞外空间的定向转运。这一活动有助于上皮细胞维持神经视网膜的健康与完整性。

我们在此描述的体外制备方法可用于在开始解剖前分析决定上皮极性和功能的转运蛋白、受体以及信号通路。在超净工作台中准备一个12孔板，并加入室温溶液。每只眼球需要1孔10倍浓度的抗生素-抗真菌素溶液、2孔1倍浓度的XPBS，以及1孔含有5% RPE培养基（含血清）稀释的每毫升2单位的裂解液空间溶液。用1倍浓度的H-B-S-S溶液填充硅胶垫底的解剖皿，吸去液体后，将每只眼球转移至1孔抗生素-抗真菌素溶液中。

在室温下孵育三到五分钟。避免对眼球施加任何过度压力。用两孔连续的1×PBS冲洗眼睛，以去除多余的抗生素。

然后用镊子将其转移至含有1倍H-B-S-S溶液的解剖皿中，在解剖体视显微镜下操作。使用虹膜剪刀去除眼球周围多余的肌肉和结缔组织。调整眼球位置，使角膜朝上。

使用两根无菌的27号针头，通过结缔组织将眼球固定在硅胶垫上，注意不要损伤巩膜。在此位置，使用侧切口刀穿过巩膜做切口。切口位置应位于从眼球赤道至前表面距离的三分之一处。

使用虹膜剪沿眼球环形继续剪开，以避免损伤视网膜色素上皮（RPE），后者因玻璃体对视网膜的牵拉而缩写为RPE。使用同一把剪刀剪开玻璃体，以分离眼前部瓣膜与眼球杯状结构。

提起眶下腺的前部并弃去。用镊子将睁开的眼球转移至培养皿的孔中。确保眼球内无气泡。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育40至60分钟。将眼睛从解剖皿转移回已盛有新鲜室温1×H-BSS的解剖皿中。将眼睛杯口朝上放置，并用2根27号针头固定。

在解剖显微镜下，使用精细镊子轻轻提起部分分离的视网膜，并用视网膜剪将其从视神经处剪下。使用虹膜剪丢弃视网膜。

从眼球周边向视神经做一切口。用5根27号针将眼球固定。为拉伸视网膜色素上皮（RPE）层，使用视网膜剪在视神经周围做环形切割。

在250倍或更高放大倍数下分离视网膜色素上皮（RPE）层。沿虹膜剪刀在视神经附近所作切口，找到RPE层边缘。使用两对镊子将RPE层及布鲁赫膜（Bruch's membrane）从脉络膜组织层中分离出来。

沿着切缘尝试多个区域，以找到视网膜色素上皮（RPE）与脉络膜之间连接最薄弱的位置。轻轻将膜向后剥离，以完全去除。将RPE组织片放入盛有室温EDTA-trips溶液的15毫升锥形管中。

收集完所有切片后，盖上管盖，将试管置于37摄氏度水浴中孵育10分钟。剧烈振荡试管，使视网膜色素上皮细胞（RPE）分散成小簇。若无深色细胞团块，则表明分离已完成。

将试管放回水浴中继续孵育五分钟。使用移液器通过轻柔的吸力去除未消化的组织残留物。将细胞在离心机中以280 × 5G离心四分钟。

弃去上清液。用15% RPE培养基将终体积补至九毫升，用移液管重悬细胞。取三毫升细胞悬液移入25平方厘米的培养瓶中。

加入2毫升新鲜的室温15%RPE培养基。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养过夜。随着培养物的成熟，其色素沉着将在三到四周后逐渐增加。

成功的培养物应达到汇合状态，且色素沉着均匀、明显。我们刚刚向您展示了如何制备人胎儿视网膜色素上皮原代培养物。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。