0 次观看 • 4:24 分钟 • April 30th, 2023
背根神经节（DRG）是将信号从外周传递到中枢神经系统的感觉神经元。相比之下，肌间神经丛神经元则参与肠道的蠕动运动。
在胰腺癌等癌症情况下，这些神经元在形态和功能上均会发生改变。为了研究神经元形态的变化，将神经细胞接种于预先包被有层粘连蛋白（laminin）并置于多孔板中的盖玻片上，并加入神经基础培养基覆盖细胞。
层粘连蛋白可促进神经突生长。将细胞孵育过夜。随后，向前三孔加入胰腺癌组织提取物培养基，向后三孔加入正常胰腺组织提取物培养基。孵育培养板。接着，使用神经元特异性抗体标记物进行免疫组织化学染色，该抗体可与神经元结合。将盖玻片置于载玻片上，并将载玻片置于倒置显微镜下观察。利用软件测量神经突密度。
在胰腺癌组织提取物中培养的背根神经节（DRG）神经元通常比在健康胰腺组织提取物中表现出更高的神经突密度。相比之下，肠肌间神经丛神经元在胰腺癌组织提取物中形成的神经突比在健康胰腺组织提取物中更长。在以下实验方案中，我们将对新生小鼠的DRG和肠肌间神经丛神经元进行体外神经可塑性检测。
— 为准备细胞培养，使用血细胞计数板估算神经元和胶质细胞的总数。然后将细胞接种到24孔板中预先包被的13毫米盖玻片上。所使用的包被材料取决于实验目的。接着向各孔中加入神经基础培养基，使细胞在过夜时间内贴附于孔板。次日，解冻添加了组织提取物的培养基或添加了细胞系上清液的培养基。
接下来，吸除背根神经节（DRGs）中的接种培养基，并用 PBS 进行一次可选的、极为轻柔的洗涤。然后，缓慢地将添加了组织提取物的培养基或添加了细胞系上清液的培养基滴加到细胞上，使其终浓度为每毫升含 100 微克。现在，将细胞在含组织提取物或细胞系上清液的培养基中，于 37 摄氏度培养 48 小时。48 小时后，吸除培养基，并用 4% 多聚甲醛固定，用于免疫染色。
对于双重免疫荧光染色，使用神经元特异性和胶质细胞特异性的标记物。进行形态学测量时，采用配备CCD相机的倒置光学显微镜，并结合自动化软件来测量神经突密度。在200倍放大倍数下，通过叠加50 × 50微米的网格来测定神经元培养物的神经突密度，并计算每个方格内的纤维密度（以相交纤维数计）。在每张盖玻片上选取四至五张具有代表性的显微照片，针对其中神经突生长最密集的四个不同区域重复上述分析。
通过标记神经突和胞体，从每张盖玻片中随机选取的30个孤立神经元中测量神经突生长长度、每个神经元的平均分支数、平均分支长度以及胞体大小。