0 次观看 • 6:26 分钟 • April 30th, 2023
在肿瘤侵袭过程中，外周的肿瘤细胞会发生上皮-间质转化（EMT），导致细胞外基质（ECM）的局部降解。我们可以在体外研究肿瘤细胞与ECM之间的相互作用。
为了研究这些相互作用，将由胰腺肿瘤细胞形成的类球体转移至含有胶原支架的培养板中，该支架内嵌有荧光示踪探针并加入培养基。肿瘤类球体会释放蛋白酶，这些蛋白酶可降解胶原蛋白，降低细胞外基质（ECM）的刚性，从而导致示踪探针在细胞外基质中自由移动。
将培养板孵育所需的时间。在光学显微镜下观察胶原支架中样品点的网格，并从中记录视频数据。类球体附近的基质区域表现出最显著的胶原降解，因此探针运动更为剧烈；相比之下，距离类球体较远的区域胶原降解较少，导致探针分子的运动受到限制。
通过测量示踪粒子的轨迹来研究细胞外基质（ECM）流变学特性的这一技术被称为粒子追踪微流变学或PTM。在以下实验方案中，我们将进行球体形成实验以鉴定胰腺癌干细胞，并评估二甲双胍的作用。
首先，在超净工作台内准备一个工作站，并放置两个2毫升小瓶。小瓶1将用于盛放肿瘤类球体，小瓶2作为无细胞对照。通过将2份储备荧光示踪探针加入25份无菌水中，配制羧基化修饰、直径为1微米的荧光示踪探针的稀释混合液。
从冰箱中取出一瓶浓度为 3.1 毫克/毫升的牛胶原蛋白，置于冰上。取 125 微升胶原蛋白溶液，加入 50 微升稀释的示踪探针溶液，置于 1 号小管中。短暂涡旋振荡，使探针分布均匀。
然后，加入235微升含有酚红的适当细胞培养基，使总体积达到410微升，短暂涡旋混匀后，取出205微升转移至2号小瓶中。接着，向1号小瓶中加入约2微升1摩尔的氢氧化钠溶液，使溶液恢复至中性pH值，短暂涡旋以混匀。随后立即放回冰架上，防止混合物开始固化。
从含有肿瘤类球体的孔中轻柔地移除 40 微升培养基。在进行下一步操作时保留这 40 微升液体。检查孔中类球体是否已在上一步被移除。若未被移除，则将这 40 微升液体重新加回孔中，并重复上一步操作。
如果存在，将含有类球体的40微升液体加入1号小管中。在将混合物以60微升等份转移至96孔板的三个独立孔之前，先轻轻搅拌1号小管。加入混合物后，用显微镜检查每个孔，以确定哪个孔含有类球体。
然后向2号小瓶中加入约2 µL的1摩尔氢氧化钠和40 µL细胞培养基，涡旋混匀，再将60 µL该混合液分装至96孔板的空孔中，并标记为无细胞对照。将该孔板置于37 °C培养箱中孵育至少1小时以完成固化。
为了构建样本点阵，首先将样本板从培养箱转移至显微镜载物台。若无加热载物台，需静置10分钟，使样本平衡至室温。使用低倍物镜观察样本，确保其结构完整且适合成像。确定肿瘤在孔内的位置，并通过透射光图像记录该位置，以便后续进行空间共定位分析。
通常，每个孔中围绕类球体呈同心圆分布的 20 个采样点即可产生足够详细的结果。移动载物台至每个目标位置，并使用显微镜配套软件记录 x 和 y 坐标。
将显微镜切换至高倍物镜，并选择与示踪探针激发波长相匹配的滤光片组。根据已创建的点位列表，移动至网格中的第一个点位。调整焦距，先找到孔底，再向上移动，直至找到一个包含多个清晰聚焦示踪探针的视野。
观察强度直方图，并调整曝光强度和时间，以在确保图像不饱和的前提下获得尽可能大的动态范围。以每帧20至30毫秒的帧率获取视频序列，并采用适当的命名规则保存。在录制过程中，切勿触碰显微镜或实验台。
对网格中的每个样本点重复进行记录。然后重复该过程，为实验中每个孔构建网格，并在纵向监测的每个时间点重复整个过程。