结直肠癌类器官细胞标记：一种生成GFP慢病毒转导的结直肠癌类器官细胞的方法

— 类器官是三维体外细胞结构，能够自我组织以模拟其来源器官的关键组织特征。开始标记时，将收获的类器官用蛋白酶和胶原酶混合液处理，使细胞解离成单细胞悬液。通过离心将细胞与含酶的上清液分离，弃去上清液。用含有慢病毒载体的培养基重悬细胞沉淀。这些重组病毒携带编码绿色荧光蛋白（GFP）的序列。

病毒与细胞融合，并将其遗传物质及某些病毒酶释放到细胞质中。病毒逆转录酶合成互补的病毒DNA，该DNA进入宿主细胞核。病毒整合酶帮助将含有GFP序列的病毒DNA整合到宿主基因组中。将这些转导后的细胞培养于细胞外基质（ECM）包被的培养板中。吸除培养基，离心收集未贴壁的细胞。将细胞重悬于额外的细胞外基质中。

将悬液覆盖于贴壁培养物上，以促进细胞存活。待基质凝固后，加入培养基并进行培养，以促进类器官形成。在荧光显微镜下观察培养物。经转导的细胞可合成绿色荧光蛋白，来源于这些细胞的类器官呈现绿色荧光蛋白阳性。以下实验方案演示了将GFP慢病毒转导至患者来源的结直肠癌类器官细胞中的操作流程。

— 培养 7 至 10 天后，使用无菌细胞刮棒机械性分离类器官，并将类器官转移至 1.5 毫升微量离心管中进行离心。随后，通过轻柔振荡将沉淀重悬于 500 微升 PBS 中，再进行一次离心。为解离结直肠癌类器官，向离心管中加入 500 微升蛋白酶和胶原酶消化液，并轻轻振荡混匀。

室温孵育10分钟后，向细胞中加入500 µL含1% FBS的培养基，并用移液器非常轻柔地反复吹打细胞悬液，以分散类器官。

在传代过程中轻柔地吹打人源结直肠癌类器官，对于维持类器官在培养中完整的球状结构至关重要。

— 再次离心细胞，并将沉淀重悬于 100 微升 5x GFP 慢病毒原液和 400 微升新鲜的结直肠癌类器官培养基中。

- 必须使用高滴度的GFP慢病毒感染人结直肠癌类器官，特别是要实现接近100%的感染效率。

— 调整各管中的体积，使每500微升培养基中含5×10⁵个解离的肿瘤细胞，按所示方法将500微升细胞悬液接种至预先包被人工细胞外基质的12孔板中。细胞在培养箱中孵育18小时后，将含有悬浮细胞的上清液转移至各自的1.5毫升微量离心管中，离心，随后在冰上用每管70微升人工细胞外基质重悬沉淀。

为了提高结直肠癌细胞的存活率，将含有肿瘤细胞的人工细胞外基质覆盖在12孔板中的肿瘤类器官上，然后将培养板放入细胞培养箱中孵育30分钟。当人工细胞外基质包被完全凝固后，加入1毫升新鲜的结直肠癌类器官培养基（添加1% FCS）进行换液，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养3天。随后，通过荧光显微镜观察感染的细胞，确认GFP阳性率接近100%，然后将细胞再次放回培养箱中继续培养4至6天。