0 次观看 • 5:19 分钟 • April 30th, 2023
首先取一只经过麻醉的条件性突变小鼠，其基因组经过修饰，携带特定的Cre重组酶识别序列，即位于目标抑癌基因两侧的LoxP插入序列。通过手术暴露腹腔，找到远端结肠并夹闭其上部。经肛门插入医用级导管，并将其推进至远端结肠。用生理盐水冲洗结肠，以清除任何粪便物质。更换导管，夹闭结肠下部以进行节段隔离。使用适当的细胞解离溶液充盈该结肠节段，从而破坏黏膜屏障，增加肠隐窝细胞的可及性。随后将解离溶液冲洗出。
接下来，将腺病毒悬液注射到结肠节段中。这些经过基因改造的病毒载体编码 Cre 重组酶。病毒进入细胞后，将其 DNA 释放到细胞核内，并表达重组酶。这些蛋白质可识别宿主基因组中的 LoxP 插入序列，并催化特定位点的重组，从而失活肿瘤抑制基因。这种功能缺失突变可促进癌症进展。缝合切口并让小鼠恢复，随后进行监测以观察孤立性结直肠肿瘤的生长情况。以下方案展示了一种通过节段性腺病毒-Cre 感染建立结直肠癌小鼠模型的方法。
— 首先将麻醉后的小鼠置于仰卧位，并在其眼睛上涂抹眼膏。用胶带将小鼠固定于适当位置，然后通过夹捏脚趾确认麻醉深度是否合适。在下腹部皮肤做一条长约15毫米的正中切口。随后用镊子夹住腹壁肌肉组织，用剪刀小心地切开肌肉以暴露腹腔。找到远端结肠后，使用精细的夹子在距离肛门约15毫米的近端位置小心夹住组织。
接下来，经肛门插入一根柔韧的聚四氟乙烯管，小心推进导管直至到达管腔阻塞处，并用一根30号导管对导管进行插管。将一支标准的1毫升注射器连接到导管上，用数毫升生理盐水冲洗结肠，直到所有粪便物质完全排出。远端结肠排空后，将生理盐水导管更换为一根新的聚四氟乙烯管，并使用第二个夹子在距离第一个夹子远端约3毫米处夹闭结肠。
使用另一个装有30号套管针的1毫升注射器，小心地将50至80微升0.25%胰蛋白酶-EDTA注入夹闭的结肠段。结肠应膨胀至足以破坏黏膜屏障，但不穿透夹闭的组织段。10分钟后，移除远端夹子，然后取下胰蛋白酶管，并用500微升生理盐水冲洗远端结肠。
插入新的聚四氟乙烯管后，再次夹住结肠，并用 50 至 80 µL 腺病毒溶液充盈组织。30 分钟后，移除夹子和导管，使用 6-0 快速吸收缝线连续缝合腹壁。用外科伤口夹闭合皮肤，并将动物置于加热垫上监测，直至其完全恢复。
为了通过结肠镜监测肿瘤生长，将麻醉后的荷瘤动物仰卧置于加热垫上，经肛门将内窥镜插入肠道。在直视下轻轻注入空气以扩张结肠。然后小心推进内窥镜，直至在远端结肠中识别出黏膜病变，并在获取每张内窥镜图像时立即保存，以供后续评估。完成所有图像采集后，缓慢撤出内窥镜，并将小鼠置于38°C加热垫上，直至完全恢复。