结直肠癌细胞中的磷酸酶活性检测：一种检测结直肠癌细胞中Tau蛋白磷酸化状态的方法

- Tau蛋白在结直肠癌细胞中定位于核仁外围，有助于维持核仁结构。这些细胞大多表达高度磷酸化的Tau蛋白，从而导致耐药性。因此，我们通过进行磷酸酶实验来分析Tau蛋白的磷酸化水平。

取两管分别标记为实验组和对照组的人源结直肠癌细胞全蛋白裂解液。对实验组样品用碱性磷酸酶处理。碱性磷酸酶可去除 tau 蛋白上的磷酸基团，而对照组管中 tau 蛋白仍保持磷酸化状态。

接下来，将样品和对照组的 tau 蛋白在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以实现蛋白质的分离。磷酸化的 tau 蛋白在凝胶中的迁移速度比非磷酸化的 tau 蛋白更慢。将蛋白质样品电转至适当的膜上，并加入针对磷酸化 tau 和正常 tau 的一抗。

将印迹膜在室温下孵育过夜。用与一抗Fc区域结合的报告酶标记的二抗处理印迹膜。最后，使用化学发光底物显影，以从印迹膜中存在的总蛋白样品中鉴定tau蛋白。在以下实验方案中，我们将展示磷酸酶活性测定法，用于评估结直肠癌（CRC）细胞中tau蛋白的整体磷酸化状态。

— 准备含有20微克总蛋白的样品后，向每个样品中加入2微升碱性磷酸酶缓冲液和10微升碱性磷酸酶。然后加入蒸馏水，使每个样品的终体积为20微升。

将样品在37摄氏度下孵育1小时。在孵育期间，同时制备相同浓度但不加磷酸酶的样品作为对照。孵育1小时后，通过加入EDTA至终浓度50毫摩尔，或加入正钒酸钠至终浓度10毫摩尔，以终止反应。

加入新配制的含有 400 毫摩尔 DTT 的 4X SDS 凝胶上样缓冲液。使用金属浴，在 100 摄氏度孵育样品 5 分钟。涡旋混匀样品，然后在室温下冷却 10 至 15 分钟。

接下来，在10%聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中加入13 µL样品以及分子量标准蛋白。将电泳系统连接至电源，设定电压为70伏，电泳20分钟，使蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶。

此后，将电压升至125伏，电泳约70至120分钟，直至样品和蛋白质ladder迁移至凝胶底部。使用湿转电泳系统，在100伏条件下电转约100分钟，将凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上。

接下来，将膜在室温下用4%牛血清白蛋白封闭90分钟。随后在4摄氏度下，将膜与一抗溶液孵育过夜。次日，用PBST洗涤膜三次，每次洗涤七分钟。

在室温下用相应的二抗溶液孵育90分钟。然后用PBST洗涤四次，每次洗涤持续7分钟。根据制造商说明书，使用化学发光试剂盒显影印迹。

将显色后的印迹膜用透明塑料膜覆盖，然后使用 commercially available 化学发光成像系统获取印迹的化学发光图像。