0 次观看 • 4:28 分钟 • April 30th, 2023
- Tau 是一种微管相关蛋白，参与微管的稳定与组装。许多癌细胞表达过度磷酸化的 Tau 蛋白，这种蛋白无法维持良好的微管结合结构。为了研究 Tau 蛋白与微管之间的相互作用，需在微量离心管中加入含有 Tau 蛋白的癌细胞裂解液和微管工作溶液。
细胞裂解液中非磷酸化的 tau 蛋白会与微管结合。现在，向试管中加入所需量的 PEM 缓冲液，以稳定微管蛋白（tubulin）的活性，该蛋白可聚合形成微管的丝状结构。将混合物孵育所需的时间。
离心混合物以沉淀微管结合蛋白。未结合的蛋白保留在上清液中。将上清液转移至新管中，并用适当的缓冲液重悬沉淀。向重悬的沉淀悬液中加入上样缓冲液，然后将样品上样至聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，以分离微管结合蛋白，并将其电转印至适当的膜上。
加入合适的抗体，并使用化学发光底物显影以鉴定结合的 tau 蛋白。在以下实验方案中，我们将进行微管结合实验，以鉴定与微管结合的蛋白质。
— 制备新鲜样品后，在37摄氏度下孵育30分钟。在25摄氏度下以100,000 × g超速离心60分钟。随后，将含有未结合tau的上清液各120微升转移至分别标记好的洁净离心管中。向含有结合tau的沉淀中加入120微升5倍浓度的上样缓冲液。
充分涡旋并用移液器混匀后，将混合物转移至洁净且已标记的离心管中。在制备好蛋白浓度相等的样品后，加入含有400毫摩尔DTT的新鲜4X SDS凝胶加样缓冲液。使用金属浴将样品在100摄氏度下孵育5分钟。
涡旋混匀样品，然后在室温下冷却10至15分钟。每孔上样13 µL，同时在10%聚丙烯酰胺凝胶上加载分子量标记。将电泳系统的正极和负极连接至电源，然后设定电压为70伏，电泳20分钟。
此后，将电压升至125伏，电泳约70至120分钟，直至样品和蛋白质ladder迁移至凝胶底部。使用湿转电泳系统，在100伏条件下将凝胶中的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上，约100分钟。将膜置于4%牛血清白蛋白溶液中，在室温下孵育90分钟进行封闭。然后在4摄氏度下，于一抗溶液中孵育过夜。
第二天，用 PBST 洗涤印迹膜，每次七分钟，共洗涤四次。将洗涤后的印迹膜在相应的二抗溶液中室温孵育 90 分钟。然后用 PBST 洗涤七分钟，重复洗涤共四次。使用化学发光试剂盒显影。用透明塑料膜覆盖后，采用化学发光成像系统采集图像。