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— 结直肠癌的三维类器官模型是一种体外培养系统,经工程化设计以模拟体内肿瘤微环境。该培养体系通常包含基质细胞(如成纤维细胞)与结直肠癌上皮细胞共同培养,并置于适宜的细胞外基质微环境中。
在已建立的培养体系中,具有转移潜能的肿瘤细胞会侵袭细胞外基质。为分离这些侵袭性细胞,首先使用甲醛处理类器官模型,以固定细胞和细胞外基质。随后用酒精孵育样本,使其脱水。
接着,将组织浸入液体石蜡中以制备组织块。使用超薄切片机获取薄切片,并将切片转移至合适的载玻片上。
加入二甲苯以脱蜡切片。随后将切片依次浸入浓度递减的乙醇中,以使样本复水。
使用焦油紫(Cresyl Violet)染色,以区分结直肠癌细胞与微环境。将染色后的玻片正面朝下放置在显微镜载物台上。利用适当的软件识别需进行显微切割的细胞,并勾画其边界。发射激光切割高亮区域,并收集显微切割的部分。
在以下实验方案中,我们将展示如何通过激光显微切割技术从三维类器官共培养模型中分离结直肠癌细胞。
— 从孔板中取出整个类器官组织(包括尼龙膜),置于保鲜膜上。使用洁净的一次性手术刀将类器官组织及尼龙膜沿中线切开为两半,将两半均在室温下用甲醛固定24小时。24小时后,用70%乙醇替换甲醛,过夜放置,随后进行石蜡包埋、切片和染色。
进行激光显微切割时,首先将器官型组织切成10微米厚度,并贴附于带膜载玻片上。按照文本方案中所述方法处理切片后,准备使用选定的平台进行激光显微切割。
将带有待显微切割染色切片的玻片正面朝下放置在显微镜载物台上。将一个0.5毫升微量离心管装入收集盒中,并向管盖内加入50微升细胞裂解缓冲液,用于收集显微切割的组织。在直视下,使用操纵杆定位目标组织,然后通过软件界面标注染色的组织切片,圈选出肿瘤浸润前沿需要进行显微切割的细胞。
指示激光发射,以切割出高亮区域并将显微切割的组织推进至微量离心管盖内。随后采用适当方法处理样品,以提取目标分析物。