小鼠背部皮肤黑色素瘤样本的冻存皮肤组织块制备方案

静息状态的黑色素细胞干细胞在受到紫外线辐射或脱毛刺激后会被激活。活化的黑色素瘤干细胞可能导致皮肤黑色素瘤——一种皮肤癌。为了研究黑色素瘤，我们制备冷冻的皮肤组织块，以便在固定过程中保持DNA和蛋白质的天然结构。

首先将一只已处死的黑色素瘤小鼠置于手术台上，去除尾部上方皮肤背侧区域的毛发。切除皮肤并用滤纸覆盖。接着，将含有皮肤组织的滤纸浸入中性缓冲甲醛溶液中固定所需时间。甲醛渗透入皮肤组织，与氨基酸结合，导致蛋白质交联，从而实现组织固定。

将皮肤组织从纸张上取下，并切割成所需大小的组织块。接着，将组织块垂直包埋于装有OCT包埋剂的冷冻模具中，并将冷冻模具置于干冰上。OCT是一种冷冻时会固化的标本包埋基质，可在组织周围形成凝胶状层，从而固定组织。将所得的冷冻组织块用于后续组织学检测。在以下实验方案中，我们将从小鼠背部皮肤制备冷冻皮肤组织块，以研究皮肤黑色素瘤。

— 要分离皮肤样本，使用电动剃毛器去除已处死的辐照小鼠背部皮肤区域的毛发，并用无绒布轻轻擦拭暴露的皮肤以清洁该区域。用锋利的剪刀在尾基部稍上方做一个小切口，将大型钝头剪刀插入切口以分离皮下结缔组织。使用锋利的剪刀，沿目标皮肤区域边缘小心剪下以分离组织样本，并将切除的皮肤组织置于干净的纸巾上。

然后，使用钝头镊子拉伸皮肤，使其紧贴毛巾并保持绷紧。当所有样品采集完毕后，立即将皮肤样品连同其下方的纸巾衬垫一起放入折叠的滤纸中，紧邻折痕放置，并注意确保样品平整，无折叠或褶皱。用订书钉封好滤纸两侧，修整纸张边缘。随后，将样品完全浸入10%中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定3至5小时，之后用去离子水清洗组织，每次5分钟，共清洗两次。

第二次洗涤后，小心清除皮肤组织上残留的任何物质，并修剪样本边缘，使其边缘平滑，无锯齿状。接着，在每个样本上做三个矢状切口，使条带的宽度不超过5毫米，并进行横向切割，使样本的宽度不超过20毫米。将含有最佳切割温度介质（OCT）的冷冻模具竖直放置，然后在OCT上放置四到五块皮肤组织。

当所有组织块就位后，使用两对精细镊子将每块皮肤的长边移至冷冻模具底部，使样本在OCT包埋剂中保持垂直，并与模具底部垂直。然后，向模具中加入额外的OCT包埋剂至第二道边缘，将模具放置在干冰的平坦表面上，并用镊子根据需要调整在转移过程中可能移位的皮肤组织块，直至包埋块开始冻结。