HCR-DNA FISH：一种用于检测感染细胞中病毒DNA的荧光原位杂交技术

— HCR-FISH（杂交链式反应-荧光原位杂交）可检测病毒感染细胞基因组中的病毒核酸序列。首先，固定贴壁培养的病毒感染细胞，并通透其细胞膜。将细胞与杂交缓冲液共同孵育，以降低背景信号。用携带HCR引发序列以及靶向病毒DNA互补序列的引发探针处理细胞。加热样本，使宿主双链DNA变性为单链DNA。孵育样本，使探针与其互补的靶病毒DNA序列结合。

接下来，使用含有两组荧光标记的寡核苷酸发夹探针 H1 和 H2 的扩增缓冲液进行处理。孵育以促进杂交链式反应。未配对的引发序列与互补的 H1 尾部结合，使发夹结构线性化。暴露的 H1 序列随后与互补的 H2 尾部结合。新暴露的 H2 末端继续与另一个 H1 尾部结合。通过这种方式，荧光标记的探针在目标位点周围扩增，产生强烈的荧光信号。用 DAPI 处理样品以染色细胞核。

使用荧光显微镜检测感染细胞核内复制灶发出的明亮荧光。在以下实验方案中，我们将展示原位杂交链式反应- DNA 荧光原位杂交（HCR-DNA FISH），用于检测感染的人原代皮肤细胞中的梅克尔细胞多瘤病毒基因组。

— 首先，用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液将细胞固定在盖玻片上，持续10分钟。随后，用PBS洗涤盖玻片两次，并在4摄氏度下用70%乙醇处理过夜，以透化细胞。次日，将乙醇替换为探针杂交前缓冲液，在室温下孵育60分钟，对样本进行预杂交。在预杂交孵育结束前30分钟，将探针按1:500的比例稀释于探针杂交液中，并在45摄氏度下孵育。

孵育完成后，为每张盖玻片吸取约10微升稀释后的探针混合液，滴加到显微镜载玻片上。将每张盖玻片有细胞的一面朝下，分别放置于对应的杂交混合液液滴上。使用足量的橡胶胶水，将每张盖玻片的边缘及其背面密封固定于载玻片上。将载玻片平放在加热块的平面上，于94摄氏度加热3分钟。随后，将载玻片转移至湿化 chamber 中，于45摄氏度过夜孵育。

第二天，使用镊子小心剥离橡胶胶水。将盖玻片有细胞的一面朝上放入24孔板的孔中，用探针洗涤缓冲液在室温下洗涤三次。向每个含有盖玻片的孔中加入200 µL扩增缓冲液，在室温下孵育30至60分钟。同时，在两个独立的PCR管中，将两种标记的寡核苷酸发夹探针分别进行退火处理：先加热至95 °C持续90秒，然后冷却至室温持续30分钟。将退火后的发夹探针按1:50的稀释比例混合于扩增缓冲液中。

接下来，将石蜡膜拉伸覆盖在12孔板盖子的开口面上，以形成扩增反应的表面。将发夹混合物以50至100微升的液滴形式移取到石蜡膜上，每个盖玻片对应一滴。使用镊子小心地从预扩增溶液中取出每个盖玻片，并将其边缘接触多孔的一次性擦拭纸以吸干。将每个干燥后的盖玻片细胞面朝下放置在扩增液滴上。将培养板盖子转移至湿润的孵育盒中，在室温下避光孵育过夜。

第二天，将盖玻片放回24孔板的各孔中。向每孔加入含有DAPI的5x SSCT，DAPI浓度为0.5微克/毫升，室温孵育1小时。随后，在室温下用5x SSCT洗涤样本两次。将洗涤后的盖玻片封片于显微镜载玻片上，使用倒置荧光显微镜观察细胞并采集样本图像。