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- 皮肤由填充其不同层的各种细胞组成。黑色素细胞，即产生黑色素的细胞，位于表皮-真皮交界处，而成纤维细胞，即产生结缔组织的细胞，位于真皮中。
要快速分离黑色素细胞和成纤维细胞，首先要取安乐死小鼠幼崽的躯干。通过躯干的长度从腹侧切开皮肤。剥去含有表皮和真皮层的皮肤，将组织切成小块。
现在，用含有胰蛋白酶和胶原酶的消化缓冲液处理，这些酶会降解细胞外基质，将细胞释放成悬浮液。离心使细胞沉淀并弃去上清液。将细胞重悬于黑色素细胞培养基中，并将悬浮液转移到多孔板中。
在培养过程中，大多数成纤维细胞粘附在孔底，而黑色素细胞和其他表皮细胞保持悬浮状态。吸出悬浮细胞，并将成纤维细胞特异性培养基添加到成纤维细胞培养物中以促进其生长。将吸出的悬浮液转移到新鲜的胶原蛋白包被的孔中，以帮助形成贴壁培养物。
补充抗生素 geneticin，并添加新鲜的黑色素细胞生长培养基。Geneticin 选择性地消除任何残留的成纤维细胞，而培养基则促进黑色素细胞在其他表皮细胞类型上的生长。在以下方案中，我们将从小鼠幼犬皮肤中分离黑色素细胞和成纤维细胞。
- 在层流柜中，在含有 70% 乙醇的无菌培养皿中短暂滚动每只安乐死小鼠的躯干。从乙醇中取出小鼠，并将其放入空的无菌培养皿中。接下来，用 70% 乙醇对手术剪刀消毒。用这些剪刀在躯干腹侧的皮肤上切开一个切口，从脖子开始，一直到尾巴。使用无菌镊子，将皮肤从小鼠的躯干上剥离，并从皮肤的真皮侧去除多余的脂肪组织。
将皮肤，真皮面朝下，放入含有 3 毫升 1x 抗生素/抗真菌溶液的 6 孔培养皿中。在室温下孵育 2 至 3 分钟。然后，打开组织切碎器并将设置调整为此处显示的设置。
- 安装卫生纸切碎机刀片和作机器时请务必小心。
- 将皮肤（真皮面朝下）转移到无菌组织切碎器培养皿中，并将皮肤完全穿过组织切碎器三次。在此之后，将匀浆的皮肤转移到含有 3 毫升皮肤消化缓冲液的无菌 15 毫升锥形管中。
使用 P1000 微量移液器，通过用力上下移液 10 到 15 次来混合所得的悬浮液。盖上锥形管，将样品在 37 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟，确保每 3 到 5 分钟倒置一次试管。
接下来，在室温下以 750 x g 的离心力在水平转子中离心试管 5 分钟，以沉淀皮肤匀浆中的细胞。使用 P1000 微量移液器缓慢完全去除皮肤消化缓冲液，注意不要打扰颗粒。
- 确保吸出所有皮肤消化缓冲液。如果您遇到问题，请用 2 至 3 毫升黑色素细胞培养基洗涤细胞沉淀，然后重复离心并去除多余的皮肤消化缓冲液。
- 然后，用 P1000 移液器上下吹打 15 至 20 次，将细胞沉淀彻底重悬于 1 毫升黑色素细胞培养基中。将所得细胞溶液逐滴转移到含有 1 毫升黑色素细胞培养基的 6 孔培养皿中的未包被孔中。将铺板的皮肤匀浆在 37 摄氏度的组织培养箱中用 5% 二氧化碳孵育 40 分钟。
在此之后，将培养上清液从未包被的培养皿转移到预洗的胶原蛋白包被的 6 孔培养皿的一个孔中。将 G418 添加到培养基中，使最终浓度为 100 ng/mL。将 2 毫升成纤维细胞培养基添加到未包被培养皿的一个孔中，现在含有贴壁成纤维细胞。将两种培养物在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的组织培养箱中孵育过夜。
孵育 16 至 24 小时后，分别吸出每种培养物中的培养基和任何碎片。每个培养皿洗涤两次，每次洗涤使用 1 毫升 PBS。然后，向黑素细胞培养物中加入 2 毫升新鲜的黑色素细胞培养基，并向成纤维细胞培养物中加入 2 毫升新鲜的成纤维细胞培养基。
