0 次观看 • 5:54 分钟 • April 30th, 2023
— 皮肤由多种细胞构成，这些细胞分布于皮肤的不同层次。产生黑色素的黑色素细胞位于表皮与真皮交界处，而生成结缔组织的成纤维细胞则位于真皮层。
为了快速分离黑色素细胞和成纤维细胞，首先取一只安乐死后的幼鼠躯干。沿躯干全长在腹侧切开皮肤。剥离包含表皮层和真皮层的皮肤，并将组织剪切成小块。
现在，使用含有胰蛋白酶和胶原酶的消化缓冲液进行处理，以降解细胞外基质，使细胞释放并悬浮于溶液中。离心以沉淀细胞，并弃去上清液。将细胞重悬于黑素细胞培养基中，并将细胞悬液转移至多孔板中。
培养过程中，大多数成纤维细胞会贴附于孔底，而黑色素细胞及其他表皮细胞则保持悬浮状态。吸除悬浮细胞，并向成纤维细胞培养物中加入成纤维细胞特异性培养基以促进其生长。将吸出的悬浮液转移至新的经胶原蛋白包被的培养孔中，以促进形成贴壁培养物。
加入遗传霉素（geneticin）（一种抗生素），并添加新鲜的黑素细胞生长培养基。遗传霉素可选择性地清除任何残留的成纤维细胞，而该培养基则促进黑素细胞相较于其他表皮细胞类型的生长。在以下实验方案中，我们将从小鼠幼崽皮肤中分离黑素细胞和成纤维细胞。
— 在超净工作台中，将每只安乐死小鼠的躯干在含有70%乙醇的无菌培养皿中快速滚动消毒。将小鼠从乙醇中取出后，放入另一个无菌空培养皿中。接着，将手术剪浸入70%乙醇中进行消毒。用该手术剪从小鼠颈部开始沿腹侧向尾部方向剪开皮肤。使用无菌镊子将皮肤从躯干上剥离，并清除皮肤真皮面多余的脂肪组织。
将皮肤置于真皮面朝下的位置，放入含有 3 毫升 1x 抗生素/抗真菌素溶液的 6 孔板中。在室温下孵育 2 至 3 分钟。然后，打开组织切片机，并将设置调整为如下所示参数。
- 安装组织切片刀片以及操作仪器时，务必小心谨慎。
— 将皮肤表皮面朝下转移至无菌组织切碎皿中，用组织切碎器将皮肤完全切碎三次。随后，将切碎后的皮肤转移至含有3毫升皮肤消化缓冲液的无菌15毫升锥形管中。
使用 P1000 移液器，通过上下剧烈吹打 10 至 15 次，混匀所得悬液。盖上锥形管盖，将样品置于 37 摄氏度水浴中孵育 15 分钟，期间每 3 至 5 分钟颠倒混匀一次。
接下来，将离心管放入水平转子中，在室温下以 750 × g 离心 5 分钟，使皮肤匀浆中的细胞沉淀。使用 P1000 微量移液器缓慢而彻底地移除皮肤消化缓冲液，注意不要扰动沉淀。
－ 确保吸净所有皮肤消化缓冲液。如果操作困难，可用 2 至 3 毫升黑色素细胞培养基洗涤细胞沉淀，再次离心，并去除多余的皮肤消化缓冲液。
— 然后，用 P1000 移液器将细胞沉淀在 1 毫升黑素细胞培养基中上下吹打 15 至 20 次，充分重悬。将所得的细胞悬液逐滴转移至 6 孔板中一个未包被的孔内，该孔中已含有 1 毫升黑素细胞培养基。将接种后的皮肤匀浆在组织培养孵箱中 37 °C、5% 二氧化碳条件下孵育 40 分钟。
此后，将未包被培养皿中的培养上清液转移至预先洗涤过的胶原蛋白包被6孔板的一个孔中。向培养基中加入G418，使其终浓度为100纳克/毫升。向含有贴壁成纤维细胞的未包被培养皿的一个孔中加入2毫升成纤维细胞培养基。将两种培养物在37摄氏度、含5%二氧化碳的组织培养孵箱中孵育过夜。
孵育16至24小时后，分别吸去每种培养物中的培养基及任何碎片。用1毫升PBS洗涤每个培养皿两次。随后，向黑素细胞培养物中加入2毫升新鲜的黑素细胞培养基，向成纤维细胞培养物中加入2毫升新鲜的成纤维细胞培养基。