重组 Merkel 细胞多瘤病毒 (MCPyV) 病毒颗粒制备：一种高效制备高滴度重组 MCPyV 病毒颗粒的技术

— Merkel细胞多瘤病毒（MCPyV）是一种具有环状基因组的双链DNA致瘤病毒，可导致Merkel细胞癌，这是一种皮肤癌。制备MCPyV病毒颗粒时，首先用含有转染试剂、病毒基因组以及两种编码促进病毒复制所需蛋白的表达质粒的混合液处理贴壁培养的包装细胞。

孵育过程中，转染试剂与质粒形成脂质复合物（lypoplexes），促进其进入包装细胞。一旦进入细胞核，细胞机制即可启动病毒基因组和质粒基因组的表达。表达质粒编码大肿瘤抗原蛋白和小肿瘤抗原蛋白。这些蛋白转移至细胞核内，驱动病毒DNA复制。随后，病毒基因组编码结构衣壳蛋白。这些蛋白进入细胞核，参与重组病毒颗粒的组装。

接下来，收获培养的细胞。用含有去垢剂和DNase的溶液处理细胞。去垢剂可裂解细胞以释放病毒，DNase则降解悬浮液中游离的质粒DNA。离心以分离沉淀中的细胞碎片。将含有病毒的上清液加载至含有适当密度梯度介质的离心管中。离心后可在梯度介质中获得富含病毒颗粒的浓缩组分。

在以下实验方案中，我们将展示利用293TT细胞制备高滴度重组MCPyV病毒颗粒的方法。

— 傍晚时分，将600万个293TT-28细胞接种至一个10厘米培养皿中，培养皿内含补充过的DMEM培养基。在37°C、5%二氧化碳条件下培养。次日早晨，确保细胞融合度约为50%。随后，用66微升转染试剂、12微克重新连接的MCPyV分离株R17b DNA、8.4微克ST表达质粒pMtB以及9.6微克LT表达质粒pADL对细胞进行转染。在37°C、5%二氧化碳条件下继续孵育过夜。

次日，当转染的细胞接近汇合时，用胰蛋白酶消化细胞并将其转移至一个15厘米培养皿中继续扩增。当该培养皿中的细胞接近汇合时，将细胞分种到三个新的15厘米培养皿中。当这些新培养皿中的细胞接近汇合时，按照文本方案中所述方法收获细胞。在室温下以180 × g离心5分钟。然后弃去上清液，加入1个细胞体积的DPBS-Mg。

加入25 µmol/L硫酸铵，随后加入0.5% Triton X-100、0.1% Benzonase和0.1% ATP依赖性DNase。充分混匀后，在37°C下孵育过夜。次日，将混合物置于冰上冷却15分钟。接着，加入0.17倍体积的氯化钠。混匀后，再于冰上孵育15分钟。在4°C下以12000 × g离心10分钟。若上清液不澄清，可轻轻倒置离心管并重复离心。

此后，将上清液转移至新管中。用含0.8摩尔氯化钠的一体积DBPS重悬沉淀。在4摄氏度下以12000 × g离心10分钟。如果上清液不澄清，轻轻倒置试管并重复离心。合并两次上清液，再次在4摄氏度下以12000 × g离心10分钟。

然后，使用移液器将碘克沙醇梯度液加入到薄壁的5毫升聚碳酸酯离心管中，具体操作如文本方案所述。将3毫升澄清的含病毒上清液加至已制备好的碘克沙醇梯度液上方。使用SW55ti转子，在16摄氏度下以234,000 × g离心3.5小时，注意将加速度和减速度均设为慢速。超速离心完成后，用硅化处理的离心管收集12个组分。