原代人角质形成细胞的基因修饰：利用重组逆转录病毒进行角质形成细胞基因操作的方法

— 角质形成细胞是表皮或皮肤最外层中的主要细胞类型。为了对角质形成细胞进行基因改造，首先培养逆转录病毒包装用Phoenix细胞。随后加入含有携带目的基因的逆转录病毒载体和转染试剂的混合物。将培养板在所需时间内孵育。

转染试剂可促进将病毒遗传物质递送至包装细胞中。这些经过特殊设计的细胞编码逆转录病毒衣壳生成所需的蛋白质，并促进携带目的基因的逆转录病毒载体RNA的包装。包装完成后，成熟的病毒颗粒从细胞释放到培养基中。现在，将含有病毒的培养基转移至含有原代角质形成细胞的新培养皿中。向培养体系中添加适量的阳离子聚合物溶液。

阳离子聚合物可中和病毒和角质形成细胞膜上的负电荷，从而提高病毒与细胞表面融合的效率。融合后，病毒将其RNA释放到细胞质中，随后逆转录为双链DNA。该病毒DNA进入细胞核并整合至角质形成细胞的基因组中，导致遗传改变。在以下实验方案中，我们将展示利用逆转录病毒转染对原代人角质形成细胞进行遗传修饰的方法。

- 转染前一天，将Phoenix细胞以每孔800,000个细胞的密度接种于6孔板中，加入完全培养基。转染当天，为每个待转染孔将6 µL转染试剂与100 µL DMEM混合，室温孵育5分钟。将该混合物加入另一离心管中，管内含有为每个待转染孔准备的3 µg逆转录病毒载体，室温孵育30分钟。将此全部混合物逐滴加入Phoenix细胞的各孔中，并将细胞置于培养箱中过夜孵育。

转染后的第二天，吸出 Phoenix 细胞中的培养基，加入 2 毫升新鲜的完全培养基。同一天，将原代人角质形成细胞重悬于含抗生素的无血清角质形成细胞培养基中，并以每孔 75,000 个细胞的密度接种至 6 孔板中。

第二天，收集含有转染后 Phoenix 细胞释放的病毒颗粒的培养基。使用注射器将培养基通过 0.45 微米滤器，以去除可能污染的细胞。向含有病毒的滤过培养基中加入终浓度为每毫升 5 微克的六亚甲基溴化铵，以促进感染过程。

然后，将2毫升病毒液加入前一天接种的角质形成细胞中。接着，将6孔板在室温下以200 × g离心1小时。离心后，移除并弃去含有病毒的培养基。用1× PBS洗涤细胞一次，然后加入新鲜的KCSFM培养基。次日，使用上述相同方法对同一批角质形成细胞再次进行病毒感染。