0 次观看 • 6:44 分钟 • April 30th, 2023
－集落形成实验用于评估单个细胞增殖并形成集落的能力。从培养皿中一块切除的小鼠背部皮肤开始实验。从皮肤腹侧刮除皮下组织和脂肪。用消化液处理组织。溶液中的蛋白水解酶可降解细胞外基质，从而诱导表皮细胞解离。
轻轻刮取表皮层，使解离的细胞和毛发释放到收获培养基中。将悬液通过适当的滤网过滤，以截留毛发或任何碎片，获得表皮细胞的单细胞悬液。取所需体积的细胞悬液，转移至含有生长停滞饲养层细胞的胶原包被培养板中。加入适宜的培养基，以促进角质形成细胞的存活。
培养过程中，角质形成细胞会贴附于饲养层细胞上。此外，这些饲养细胞可分泌生长因子并合成细胞外基质蛋白，从而支持角质形成细胞的生长。根据单个角质形成细胞的增殖能力，它们开始形成克隆集落。弃去培养基并固定克隆集落。使用适当的染料对细胞进行染色，以识别可用于计数的克隆集落。在以下实验方案中，我们将对经测试化合物处理后从成年小鼠中分离得到的原代角质形成细胞进行克隆形成能力检测。
— 从安乐死的成年小鼠身上采集背部皮肤样本后，使用经高压灭菌的镊子和手术刀，将一块背部皮肤（毛面朝下）依次放入一个薄的培养皿中，刮除皮下组织，包括皮肤组织腹侧的脂肪，直至组织呈半透明状。
将刮取的皮肤置于 PBS 中，直至所有剩余皮肤处理完毕。随后，使用解剖刀将皮肤样本切成 0.5 × 1 至 1.5 厘米的条状。将条状样本毛面朝上放置于无菌培养皿中，然后将其毛面朝上漂浮于塑料 100 × 20 毫米培养皿中 20 毫升 PBS 加 2× 庆大霉素并补充 0.25% 胰蛋白酶的溶液表面，在 32°C 下孵育 2 小时。
孵育结束后，将一个含有15毫升收获培养基的无菌塑料方形培养皿倾斜30度放置，用弯头镊子小心地将一片漂浮的皮肤条转移至培养皿中。取一把新的刀片，使其与皮肤表面垂直，施加足够但不过度的力量，将表皮和毛发从样本上刮下并落入培养基中。
当所有组织条均刮取完毕后，小心地将含有表皮细胞的上清液倾入一个无菌的60毫升广口瓶中，瓶内含有一根1.5英寸的磁力搅拌子，并用额外的收获培养基冲洗培养皿，以收集残留的任何表皮细胞。
加入新鲜培养基，将瓶中的终体积调至30毫升，在室温下以每分钟100转的速度搅拌表皮细胞悬液20分钟。搅拌孵育结束后，在生物安全柜中取出搅拌子，并通过70微米滤网将细胞悬液过滤至50毫升锥形管中。
使用镊子，然后用移液器将毛发和角质层组织压过滤网，以操作组织并释放被困的毛细胞，并用额外的5毫升收获液将残留的被困毛细胞释放到试管中。
必须对表皮细胞和毛发进行适当操作，以使细胞从毛囊中释放出来。
— 用新鲜培养基将管中的总体积补至 50 毫升，通过离心收集细胞滤液。将沉淀重悬于 5 毫升新鲜收获培养基中，并用 5 毫升移液器吹打约 20 次。取 0.5 毫升 1:20 稀释液，转移至 2 毫升微量离心管中。
小心混匀样品后，从微量离心管中取 200 µL，与等体积的 0.4% 台盼蓝溶液轻轻混匀。将此溶液轻轻混匀三次，然后转移至血细胞计数板，用于计数有核角质形成细胞。
将所有深蓝色细胞记为非活细胞，将小型金粉色细胞记为活细胞。细胞活力平均约为80%，每只小鼠最终应获得约3000万个活细胞。计数后，通过再次离心收集细胞；进行大量培养时，将每35毫米培养皿中2至4×10⁶个活角质形成细胞重悬于2毫升细胞培养基中。
进行克隆形成实验时，将细胞重悬于4毫升改良William's E培养基中，每皿含1 × 10³个角质形成细胞，培养基中包含补充物和血清，置于经X射线照射的Swiss小鼠3T3饲养层上，培养容器为胶原包被的60毫米培养皿。
进行大规模培养时，在32摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞，培养时间根据具体细胞类型确定；接种后24小时首次换液，之后每周换液三次。
克隆培养结束后，吸除培养基，并在室温下用10%缓冲福尔马林固定克隆，过夜。次日早晨，用无菌水中配制的0.5%罗丹明B染色1小时，然后用冷的无菌水冲洗培养皿，直至冲洗液澄清。随后将培养皿倒置在皿盖上晾干，再进行克隆计数。