角质形成细胞集落形成测定:一种评估角质形成细胞生长成集落能力的体外测定

- 集落形成测定确定单个细胞增殖和形成集落的能力。从培养板中切除的小鼠背皮开始。从皮肤腹侧刮掉皮下组织和脂肪。用消化液处理组织。溶液中的蛋白水解酶降解细胞外基质，诱导表皮细胞解离。

轻轻刮擦表皮层，将解离的细胞和毛发释放到收获培养基中。通过适当的过滤器过滤悬浮液，以捕获毛发或任何碎屑，并获得表皮细胞的单细胞悬浮液。将所需体积的这种细胞悬液转移到含有生长停滞饲养细胞贴壁层的胶原包被板中。补充有利于角质形成细胞存活的合适培养基。

在培养过程中，角质形成细胞附着在饲养层上。此外，这些饲养细胞分泌生长因子并合成支持角质形成细胞生长的细胞外基质蛋白。根据单个角质形成细胞的增殖能力，它们开始形成菌落。去除培养基并固定菌落。用合适的染料对细胞进行染色，以检测菌落以进行计数。在以下方案中，我们将对用测试化合物处理后从成年小鼠收获的原代角质形成细胞进行克隆形成测定。

- 从安乐死的成年小鼠收集背皮样本后，使用高压灭菌的镊子和手术刀将一次一个背侧皮肤（毛面朝下）放入薄培养皿中，刮掉皮下组织，包括皮肤组织腹侧的脂肪，直到组织半透明。

将这个刮下的皮肤放入 PBS 中，直到所有其他剩余的皮肤都被处理完。然后，用手术刀将皮肤样本切成 0.5 x 1 至 1.5 厘米的条状。将条带毛面朝上放入无菌培养皿中，然后将样品毛面朝上漂浮在 20 毫升 PBS 加 2x 庆大霉素溶液的表面，并在 100 x 20 毫米塑料培养皿中补充有 0.25% 胰蛋白酶，在 32 摄氏度下放置 2 小时。

在孵育结束时，将含有 15 毫升收获培养基的无菌塑料方形培养皿倾斜 30 度，并使用弯曲的镊子小心地将漂浮的皮肤条转移到培养皿中。将新的手术刀刀片与皮肤垂直，用足够但不过度的力，将样品上的表皮和毛发刮到培养基中。

刮完所有条带后，小心地将含有表皮细胞的上清液倒入装有 1.5 英寸磁力搅拌棒的无菌 60 毫升罐中，并用额外的收获培养基冲洗培养皿以收集任何剩余的表皮细胞。

用新鲜培养基将罐中的最终体积调至 30 mL，并在室温下以每分钟 100 转的速度搅拌表皮细胞溶液 20 分钟。在搅拌孵育结束时，在生物安全柜中，取下搅拌棒，并通过 70 微米过滤器将细胞溶液过滤到 50 mL 锥形管中。

使用镊子，然后用移液管将毛发和角质层材料通过过滤器按压，以纵组织以释放被困的毛细胞，并使用额外的 5 毫升收获培养基将剩余的被困毛细胞释放到管中。

-纵表皮细胞和毛发以从毛囊中释放细胞至关重要。

- 用新鲜培养基使试管中的总体积达到 50 mL，并通过离心收集细胞滤液。将沉淀重悬于 5 毫升新鲜收获培养基中，并用 5 毫升移液管研磨约 20 次。取 0.5 mL:20 稀释液，将其转移到 2 mL微量离心管中。

仔细混合样品后，从微量离心管中取出 200 μL，与等体积的 0.4% 台盼蓝溶液轻轻混合。轻轻混合该溶液 3 次，然后将细胞转移到血细胞计数器中以计数有核角质形成细胞。

将所有深蓝色细胞评分为非活细胞，并将金黄色的小细胞评分为活细胞。活力平均约为 80%，每只小鼠的最终角质形成细胞产量应约为 3000 万个活细胞。计数后，用另一次离心收集细胞，对于大规模培养，在 2 毫升细胞培养基中每 35 毫米培养皿重悬 2 至 4 倍 10 至 6 个活的角质形成细胞。

对于克隆形成集落形成测定，在 X 射线照射的瑞士小鼠 3T3 饲养层上，每 4 毫升含补充剂的改良 William's E 培养基以 1 倍 10 至第三个角质形成细胞和血清浓度重悬每个胶原包被的 60 毫米培养皿的细胞。

对于大规模培养，在 32 摄氏度、5% 二氧化碳中培养培养物适当的细胞培养期，在初始接种后 24 小时更换培养基进行大规模培养，此后每周更换 3 次。

在克隆培养结束时，吸出培养基并将菌落固定在 10% 缓冲福尔马林中，在室温下过夜。第二天早上，用 0.5% 罗丹明 B 的高压灭菌水对菌落染色 1 小时，然后用冷的高压灭菌水冲洗培养皿，直到水变清。然后，将盘子盖子上的盘子倾斜晾干，然后再计算菌落数。