基于 miniCoopR 载体的转基因:一种在斑马鱼肿瘤模型中筛选黑色素瘤诱导基因的技术

- 在斑马鱼中，黑色素瘤是由黑色素细胞（产生黑色素的细胞）的恶性转化引起的。要研究黑色素瘤的发作，请使用黑色素瘤易发、黑色素细胞缺陷的转基因斑马鱼模型。该模型由于其黑色素细胞特异性 mitfa 启动子的功能丧失突变而缺乏黑色素细胞。

首先在琼脂平板上取这种转基因模型的单细胞胚胎。将含有基于转座子的 miniCoopR 载体和转座酶 mRNA 的混合物共注射到胚胎中。该载体包含一个基因盒，包括一个携带启动子的 mitfa 小基因，该基因与夹在两个转座子元件之间的候选基因偶联。

共注射的 mRNA 编码转座酶蛋白。这些蛋白质作用于转座子元件，催化从 miniCoopR 载体中切除盒，然后将其整合到胚胎的基因组 DNA 中。随后，盒启动子驱动 mitfa 基因和目标候选基因的表达。

mitfa 基因支持黑色素细胞的拯救和发育，而候选基因如果致癌，会诱导黑色素瘤的发作。筛选发育的斑马鱼。获救的黑色素细胞的转基因鱼会出现黑色素沉着，而携带黑色素瘤的转基因鱼则带有凸起的色素病变。

在以下方案中，我们将展示在转基因斑马鱼肿瘤模型中使用 miniCoopR 载体筛选黑色素瘤发病修饰剂。

- 要生成用于注射的构建体，首先通过 PCR 扩增目标基因的全长开放阅读框并重组到 pDONR221 中来创建 Gateway 中间进入克隆。然后，使用 Multisite Gateway 技术将黑色素细胞特异性 mitfa 启动子、目标基因和多聚腺苷酸化信号重新组合到 miniCoopR 载体中，将目标基因置于 mitfa 启动子的控制下。

将每个克隆的 25 皮克以及 25 皮克的 Tol2 转座酶 mRNA 注射到单细胞、转基因、三纯合子斑马鱼胚胎中。mitfa-BRAF-p53 突变动物是黑色素细胞缺陷的，容易发生转化和黑色素瘤形成。除了目标基因外，miniCoopR 载体还包含一个拯救 mitfa 小基因。因此，成功注射的动物将产生拯救的黑色素细胞，这些细胞表达感兴趣的基因。

在 28.5 摄氏度下孵育注射的胚胎。在受精后 24 小时 （hpf） 取出任何死胚胎。受精后 72 小时，在白色背景下的入射光下使用解剖显微镜，选择具有拯救的黑色素细胞的转基因动物。

当动物受精后 4 天时，将它们转移到斑马鱼设施苗圃的 3 升水箱中。在 2 个月大时，选择至少有一个黑色素细胞拯救面积大于 4 平方毫米的动物。每周筛查选定的动物是否存在肿瘤。分离荷瘤动物进行研究。

在横坐标上绘制无黑色素瘤生存曲线，在横坐标上绘制无黑色素瘤生存率。将动物与表达目的基因的黑色素细胞与在黑色素细胞中表达 EGFP 的对照动物进行比较。使用对数秩检验可以确定两条曲线在统计意义上是否不同。