基于miniCoopR载体的转基因技术：一种在斑马鱼肿瘤模型中筛选黑色素瘤诱导基因的方法

在斑马鱼中，黑色素瘤起源于产生黑色素的细胞——黑色素细胞的恶性转化。为了研究黑色素瘤的发生，可使用一种易发黑色素瘤但缺乏黑色素细胞的转基因斑马鱼模型。该模型由于其黑色素细胞特异性mitfa启动子发生功能缺失突变，因而缺乏黑色素细胞。

首先，在琼脂平板上取一个该转基因模型的单细胞胚胎。将含有基于转座子的miniCoopR载体和转座酶mRNA的混合物共注射到胚胎中。该载体包含一个基因表达盒，其中含有启动子驱动的mitfa微型基因，该基因与候选基因相连，两者共同位于两个转座子元件之间。

共注射的mRNA编码转座酶蛋白。这些蛋白作用于转座子元件，催化表达盒从miniCoopR载体上切出，并将其整合到胚胎的基因组DNA中。随后，表达盒中的启动子驱动mitfa基因和目的候选基因的表达。

mitfa 基因支持黑色素细胞的挽救和发育，而候选基因若具有致癌性，则会诱导黑色素瘤的发生。对发育后的斑马鱼进行筛选。携带被挽救黑色素细胞的转基因鱼会发育出黑色素沉积，而携带黑色素瘤的个体则会出现隆起的色素性病变。

在以下实验方案中，我们将展示利用 miniCoopR 载体在转基因斑马鱼肿瘤模型中筛选黑色素瘤发生修饰因子的方法。

— 为了构建用于注射的载体，首先通过PCR扩增目的基因的全长开放阅读框，并将其重组至pDONR221中，以构建Gateway中间入口克隆。随后，利用多片段Gateway技术，将黑色素细胞特异性的mitfa启动子、目的基因以及多聚腺苷酸化信号共同重组至miniCoopR载体中，从而使目的基因受mitfa启动子的调控。

将每个克隆的25皮克与25皮克Tol2转座酶mRNA共同注射到单细胞期、转基因、三重纯合的斑马鱼胚胎中。mitfa-BRAF-p53突变型个体缺乏黑色素细胞，且易于发生转化并形成黑色素瘤。miniCoopR载体除目的基因外，还包含一个可挽救表型的mitfa微型基因。因此，成功注射的个体将发育出被挽救的黑色素细胞，这些细胞表达目的基因。

将显微注射后的胚胎置于28.5摄氏度下孵育。受精后24小时（hpf）移除所有死亡胚胎。受精后72小时，在白色背景下使用解剖显微镜在透射光下筛选具有恢复黑色素细胞的转基因个体。

当动物发育至受精后4天时，将其转移至斑马鱼养殖设施的育苗区中的3升水族箱中。在2月龄时，挑选出至少有一个黑色素细胞修复区域大于4平方毫米的个体。每周对所选个体进行一次肿瘤发生情况的筛查。将携带肿瘤的个体分离出来用于研究。

以年龄和周数为横坐标，以无黑色素瘤生存率为纵坐标，绘制无黑色素瘤生存曲线。比较黑色素细胞中表达目的基因的动物与黑色素细胞中表达EGFP的对照动物。采用log-rank检验判断两条曲线是否存在统计学差异。