0 次观看 • 3:45 分钟 • April 30th, 2023
— 转录因子是一类含有DNA结合结构域的蛋白质，可结合特定的DNA序列，从而帮助调控细胞中基因的表达。为检测与鳞片相关的黑色素细胞中转录因子的表达，首先从麻醉的斑马鱼身上采集深色色素的背部鳞片，固定鳞片后用通透化溶液处理，使单个黑色素细胞具有通透性。
使用漂白液处理，以去除细胞中深色的黑色素颗粒。此漂白过程可消除后续染色步骤中由色素引起的背景信号干扰。随后用含有蛋白质的封闭液孵育，以封闭细胞表面非特异性的蛋白质结合位点。
现在，用所需的一抗处理样本。这些抗体可结合细胞内相应的靶转录因子。接着，使用荧光标记的二抗对样本进行标记，该二抗需特异性识别所使用的一抗。此外，用适当的荧光DNA结合染料处理样本，以染色细胞核。利用荧光显微镜检测转录因子-抗体复合物和细胞核发出的明亮荧光信号。
在以下实验方案中，我们将展示在转基因斑马鱼中表达黑色素细胞诱导转录因子A（mitfa）的背部鳞片相关黑色素细胞的免疫染色。
— 进行免疫染色时，用浓度为 0.17 毫克/毫升的三卡因（Tricaine）麻醉斑马鱼。在解剖显微镜的透射光下，使用锋利的细头镊子拔除背侧鳞片，注意避免损伤含有黑色素细胞的鳞片半侧。将镊子上的鳞片直接放入 1 毫升固定液中，在室温下避光固定，同时轻轻振荡，时间不少于 2 小时。将鱼转移至养鱼用水中，并观察鱼的状态，确认其恢复正常活动。
为了漂白有色素的黑色素细胞，首先在室温下用PBST清洗固定好的鳞片，每次5分钟，共清洗两次。接着，加入1毫升新鲜配制的漂白液，并用封口膜或管盖密封，以防止气体积聚导致管子爆开。继续漂白至色素完全消失。然后在室温下用PBST清洗四次，每次5分钟。
在封闭液中孵育至少30分钟。然后，在室温下用约400微升含一抗的封闭液孵育过夜。次日，在室温下用PBST洗涤鳞片三次，每次30分钟。在室温下用二抗孵育2小时至过夜。
DAPI 染色后，取一滴 Vectashield 滴加到载玻片上，将鳞片放置其上，使鳞片的凹面朝下紧贴载玻片。将盖玻片覆盖在样品上。用透明指甲油密封边缘，然后在荧光显微镜下观察玻片。