皮下移植实验：一种将黑色素瘤细胞从供体移植到受体斑马鱼模型的方法

— 在黑色素瘤移植实验中，将荷瘤斑马鱼的癌细胞移植到免疫缺陷的受体模型中，以研究肿瘤发育。首先取一只已处死的荷瘤供体斑马鱼，通过手术将其体内的肿瘤切除。将肿瘤组织转移至含有适当缓冲液的培养皿中，并将其切碎成小块。

接下来，使用移液器反复吹打肿瘤组织碎片，以将肿瘤组织解离为单个细胞。然后，将肿瘤细胞悬液装入注射器中。随后，将一条免疫缺陷型受体Casper斑马鱼置于滤纸上进行准备。这种色素缺陷型的斑马鱼突变体缺乏黑色素细胞和虹彩细胞，因而通体透明，适用于成像和移植实验。

接下来，将预加载的黑色素瘤细胞悬液皮下注射至斑马鱼腹腔上方区域，位置位于后脑与背鳍之间的中点处。随后，将受体鱼转移至水中，并对其进行监测以观察肿瘤的形成。斑马鱼透明的身体有助于清晰地观察所形成的肿瘤。

在以下实验方案中，我们将展示如何将转基因肿瘤携带型斑马鱼供体中的黑色素瘤细胞移植到免疫缺陷型受体Casper斑马鱼模型中。

— 在移植前一日，对受体2至3月龄的Casper鱼进行25 Gy伽马射线照射后，将其放回鱼水中恢复。使用三卡因处死荷瘤鱼，切下肿瘤并置于含有约5毫升滤膜灭菌的0.9x PBS（含5% FPS）的培养皿中。在溶液中用剃刀将肿瘤组织切碎。

在室温下操作，使用 P1000 移液器吹打以获得单细胞悬液。用溶液定容至 25 毫升。通过 40 微米细胞筛过滤，然后在台式离心机中以 453 ×g 离心 10 分钟。将沉淀重悬于 0.9% PBS 含 5% FBS 的溶液中，调整至所需浓度。

使用血细胞计数板，计算出准确的细胞数量，并将细胞悬液稀释，使最终注射体积约为 5 微升。例如，若需注射 50,000 个细胞，则应将细胞悬液稀释至终浓度为每微升 10,000 个细胞。每隔几分钟轻弹含有细胞悬液的离心管，以防止细胞聚集。

使用100%乙醇和0.9倍磷酸盐缓冲液（PBS），在将5微升细胞悬液装入26号针头（斜面尖端）701N型10微升Hamilton注射器之前，清洗该注射器2至3次。将经三卡因麻醉的辐照受体鱼置于湿润的Kimwipe纸上，侧卧放置。

用一只手固定鱼体，将针头斜面向上，以约45度角插入鱼体侧腹部位，位置位于后脑下缘与背鳍前缘之间约中点处，且高于腹膜腔。轻柔下压注射器推杆。将鱼放入新鲜的养鱼用水中使其恢复，并每日观察肿瘤是否成功移植。若移植成功，可进一步观察肿瘤的持续生长及疾病进展。