引物的适体的选择，使用一个随机DNA文库
July 26th, 2010
SELEX协议包括多轮选拔，其中每一个需要结合的配体，这反过来又需要固定的引物序列，侧翼的随机库地区的再生。这些固定的引物序列，可以干扰与选择过程（误报和底片）。在这里，我们目前无底漆的协议。
该程序的总体目标是从随机文库中识别 abers，在这种情况下，它与靶蛋白 S 100 B 蛋白特异性结合。这是通过首先用限制性核酸内切酶消化文库以从侧翼固定引物序列中释放随机序列来实现的。该程序的第二步是将随机文库序列与纯化的 S 100 B 蛋白结合并回收它们。
该程序的第三步是通过杂交和连接将结合序列与固定引物序列重新结合。该程序的最后一步是转录连接的产物，以允许 R-T-P-C-R 重新扩增候选 abers 的结合库，然后进行该选择程序的其他轮次。最终，可以获得显示所选 abers 与 S 100 B 蛋白特异性结合的结果。
例如，在这里，使用微阵列进行夹心结合测定，荧光标记的第二 abers 测定也使用功能化的纳米线和与 15 纳米金纳米颗粒偶联的第二 abers 进行。今天我们将展示一个选择最佳方法的程序，它从 D 序列的随机文库中与 S 00 B 蛋白结合。我们在实验室中将此程序用于各种目的，包括开发用于癌症早期检测的传感器平台。
那么让我们开始吧。要开始此过程，请按照前面所述生成无引物或 PF DNA 文库。切割双链 DNA 文库，然后用 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶进行凝胶纯化，将在 30 cc 中产生 5 个磷酸引物的 32 个核苷酸片段，在 30 cc 中得到一个 5 个磷酸素的 30 个核苷酸片段，分别命名为 32 plus 和 30 plus 片段。
32 plus 片段包含 30 个核苷酸的随机结构域，三个主要末端具有 CC 最小侧翼序列，而 30 plus 片段仅由 30 个核苷酸的随机结构域序列组成。为了制备用于 aptr 选择的 PF 文库 DNA 片段，将 32 个和 30 个以上的片段分别悬浮在 40 微升 20 毫 tris、HCL pH 7.4 中。然后在孵育后在 85 摄氏度下将样品加热 3 分钟。
冷却后，样品在 37 摄氏度的水浴培养箱中放置 3 分钟，然后以 760 微升的选择、缓冲并在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。3 分钟后，将样品在室温下放置 10 分钟。孵育后，将溶液通过含有用选择缓冲液预洗的镍 NTA agro 珠的色谱柱。
要去除非特异性 DNA，请收集不与色谱柱结合的 PF 文库 DNA 片段，并留作备用。要制备 S 100 B 结合珠，首先在微量离心机中离心 400 μL 镍 NDA 珠 3 秒，然后弃去上清液。然后用 400 μL 结合缓冲液轻轻移液 5 次洗涤珠子。
然后旋转珠子并丢弃上清液。重复此作。洗涤两次。
接下来，在珠子上先前纯化的不良组氨酸标记蛋白。这里，人 S 100 钙结合。使用蛋白 B，每 3 分钟轻轻上下吹打溶液 5 次，总共 15 分钟。
15 分钟后，旋转微珠并弃去上清液。最后，用 400 μL 选择缓冲液轻轻上下抚摸 3 次，洗涤微珠结合的 S 100 B。再次，将珠子向下旋转并丢弃上清液。
重复此步骤两次，总共进行三次最终洗涤，以选择 S 100 B 结合的 abers。检索之前放在一旁的 32 plus 和 30 plus 片段。将片段添加到结合的磁珠 S 100 B 中，然后将样品孵育 15 分钟。
15 分钟后轻轻上下移液，每 3 分钟混合一次，短暂旋转珠子，弃去上清液，然后轻轻移液，用 800 μL 选择缓冲液洗涤 S 100 BDNA 复合物。然后将珠子向下旋转并丢弃上清液。重复此洗涤步骤两次。
要回收 S 100，请选择 200 微升 20 毫摩尔 tris、HCL pH 7.4 的 abers 到珠子中。然后在 85 摄氏度下加热浆料三分钟。孵化后。
将珠子涡旋一分钟，然后向下旋转。然后将上清液转移到新试管中。重复此步骤一次并合并上清液。
最后，纯化选定的 DNA 片段。用等体积的苯基氯仿、异丙醇提取 PCR 产物两次。用 250 毫摩尔氯化钠和 2.5 倍体积的 100% 乙醇在零下 70 摄氏度沉淀 15 分钟。
在21， 000 GS 和 4 摄氏度下旋转 15 分钟。然后丢弃上清液。用 75% 乙醇高效冲洗沉淀。
在 21， 000 GS 下，在 4 摄氏度下旋转 5 分钟，然后弃去上清液。10 轮选择后，在高速真空中干燥沉淀 3 分钟。将得到的 PCR 扩增的 DNA 片段克隆到从 vitrogen 核心获得的 PCR 2.1 拓扑载体中。
然后使用 M 13 正向引物对选定的 N 30 cc 和 N 30 片段的每个 40 到 50 个单菌落进行测序。使用 infomax 载体 NTI 软件对齐选定的序列。然后根据比对确定共有序列。
一旦确定了共有序列，请按照书面协议中的说明购买共识 abers。将打印缓冲液中用五素 Amin C 六部分合成的第一个适体悬浮至终浓度为 15 微摩尔。然后使用 apogen discoveries 微网格阵列将适配体溶液定位到代码链接激活的载玻片上。
以下代码链接推荐的协议。使用 12 个数组打印每张幻灯片。使用 2 x 8 格式。
用于杂交的微阵列杂交盒。在 70 微升 PBS 中将 S 100 B 蛋白稀释至适当浓度。然后将溶液涂在微阵列盒的孔中。
使用无核酸酶的粘性天花板箔密封微阵列盒以防止蒸发。让蛋白质与印在代码链接上的 abers 结合。单独孵育后，在室温下滑动 1 小时。
用 PBS、5 毫摩尔氯化镁或 PBSM 洗涤盒的孔 3 次。接下来，在 70 微升 PBSM 中将荧光标记的第二 abers 稀释至 0.125 微摩尔。将混合物在 85 摄氏度下加热 3 分钟。
然后让标记的 ABERS 在冰上冷却。将 abers 贴在微阵列芯片盒的孔上 3 分钟。同样，用胶膜密封凝胶盒，并在室温下孵育 1 小时。
同样，个人。洗涤后用 PBSM 洗涤孔 3 次。拆卸盒并用 PBSM 冲洗整个载玻片。
然后通过离心彻底干燥载玻片。最后，使用扫描 Packard Biosciences 扫描阵列扫描载玻片。测定 γ P 32 A TP 五个主要末端标记的适配体与 S 100 B 蛋白的 4， 000 XL 结合，并与浓度作图 KD 测定。
经过大约七轮选择后的代表性 kds 通常在 10 到负 7 摩尔范围内。将 5 个主要靶向 dert 第一个适配体与代码链接微阵列偶联，纯化的 S 100 B 蛋白与第一个优化子结合，LOR 5 46 标记第二个。Optimer 与第一个 optimer S 100 B 复合物结合。
使用扫描阵列扫描仪定量荧光。中间行显示了夹心结合萎缩，其特征是在上行和下行的 KD 测定中加性结合。abers 没有夹心结合，使用标准硫醇化学将 5 个主要巯基衍生的第一个 abers 偶联到金纳米线上。
以相同的方式将 Second abers 与 50 NMO 或金 nps 偶联。然后，纯化的 S 100 B 蛋白首先与衍生的纳米线结合，第二个适配体 50 纳米摩尔金 mps 随后与第一个适配体纳米线 S 100 B 复合物结合。使用 F FE SEM 可视化结合的夹心复合物。这里。
使用 HTRA one 蛋白代替 S 100 B 蛋白进行的结合测定可以看到阴性对照。好的，关于该程序，最重要的一点是，我们使用的是无引物方法，我们没有固定的序列，这可能会导致基于序列的假阳性和假阴性，序列本身压倒了随机区域。在执行此程序时，重要的是要确保在每次逆转录反应之前销毁 DNA 模板，并在每次重新扩增后小心分离特定的 R-T-P-C-R 产物。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文介绍了一种无引物协议，用于从随机DNA库中选择特异性结合S100B蛋白的适配体。该方法旨在通过消除固定引物序列的干扰来提高SELEX协议的效率。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质工程
- 生物技术
背景
- SELEX协议通常需要固定的引物序列，这可能导致假阳性和假阴性结果。
- 从随机库中识别特异性结合物对于各种应用至关重要，包括传感器开发。
- S100B蛋白是一个感兴趣的目标，因为它与癌症检测相关。
- 由于存在固定序列，传统方法可能会阻碍选择过程。
研究目的
- 开发一种无引物的方法来选择结合S100B蛋白的适配体。
- 简化SELEX过程并提高特异性。
- 为该领域的研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 消化随机DNA库以移除固定引物序列。
- 库与纯化的S100B蛋白结合。
- 结合序列与固定序列重新结合的杂交和连接。
- 通过R-T-P-C-R进行选择的适配体的转录和扩增。
主要结果
- 成功识别特异性结合S100B蛋白的适配体。
- 通过使用微阵列的三明治检测法证明结合。
- 使用功能化的纳米线和金纳米粒子验证选择的适配体。
- 强调了在早期癌症检测中的潜在应用。
结论
- 无引物协议通过减少干扰来增强SELEX过程。
- 选择的适配体在生物传感应用中显示出前景。
- 该方法可以适用于S100B蛋白之外的各种目标。
常见问题
Executive Industry Relevance
Primer-free aptamer selection addresses a critical bottleneck in early discovery by eliminating fixed sequence interference, enabling more accurate identification of high-affinity binders. This innovation enhances predictive confidence in target validation and supports robust assay development for protein targets such as S100B. The approach is strategically relevant for biopharma portfolios seeking reliable molecular recognition tools for diagnostics and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased interrogation of molecular interactions by removing primer-induced artifacts.
- Improves functional target validation by isolating aptamers with true specificity for the protein of interest.
- Supports predictive confidence in downstream biological assays and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated aptamer libraries for high-throughput screening platforms.
- Enhances assay reproducibility by minimizing sequence-related variability.
- Delivers quantitative binding data (e.g., Kd values) for reliable compound or biomarker evaluation.
- Enables scalable and reusable assay formats, including microarrays and nanowire-based sensors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns aptamer selection with disease-relevant protein targets such as S100B, supporting translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating robust molecular probes.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by ensuring aptamer specificity.
Pipeline & Workflow Integration
This primer-free selection method integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating aptamers with minimal sequence bias.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative binding outputs suitable for high-throughput and multiplexed assays.
- Analytics: Provides robust Kd measurements and consensus sequence identification for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment with disease biomarkers and supports continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for aptamer selection against diverse protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes aptamer selection, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of molecular diagnostics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid chemistry and protein biochemistry.
- Needs access to instrumentation for DNA purification, amplification, and microarray or nanowire assays.
- Demands cross-team standardization of selection and validation protocols.
- Adaptation may be needed for different protein targets or sample matrices.
- Careful control of template destruction and product isolation is essential to avoid false positives.
