Name: 引物的适体的选择，使用一个随机DNA文库 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 了解无引物SELEX技术筛选特异性结合S100B蛋白的适体方法。该方法通过消除固定引物序列干扰，提高DNA随机文库筛选效率，适用于癌症早期检测等生物传感应用。

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感谢微阵列核心设施的Craig Paul提供的帮助。本工作由IMAT项目资助，资助编号为NIH/NCI #CA118591。SLD还感谢宾夕法尼亚太空资助联盟奖学金提供的经费支持。本出版物还得到了宾夕法尼亚州立大学材料研究所纳米制造网络以及美国国家科学基金会合作协定No. 0335765（国家纳米技术基础设施网络）的支持，合作单位为康奈尔大学。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotMaster TAQ DNA 聚合酶</td><td>5 PRIME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA 标记物</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-dCTP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯酚:ChCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X射线胶片</td><td>ECE Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖珠</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯柱</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detroit-551 细胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SK-MEL-31 细胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sp6 RNA 聚合酶</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase I</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase抑制剂</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiScript 逆转录酶</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCR-2.1-TOPO 载体</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector NTI</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用随机dna文库进行无引物适配体筛选

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

适配体是一类具有高度结构化的寡核苷酸（DNA 或 RNA），其与靶标的结合亲和力可与抗体相媲美1。它们通过一种名为指数富集配体系统进化（SELEX）的体外筛选过程被鉴定出来，能够识别多种多样的靶标，从小分子到蛋白质及其他大分子均包括在内2-4。适配体具有一系列适合体内诊断和/或治疗应用的特性：除了具有良好的特异性和亲和力外，它们易于合成，能耐受更严苛的处理条件，免疫原性低，且因其相对较小的分子尺寸，可更容易地穿透组织。
通过标准SELEX流程筛选出的适配体通常包含约80个核苷酸（nt），因为它们通常来源于具有约40 nt长随机区域的核酸文库，两侧各带有约20 nt的固定引物序列。因此，这些固定引物序列可能占文库序列的近50%，在筛选过程中可能对适配体的识别产生正面或负面的干扰3，尽管生物信息学分析表明，固定序列在筛选完成后对适配体结构的贡献并不显著5。为解决这些潜在问题，研究人员已在SELEX循环过程中使用互补寡核苷酸阻断引物序列，或将引物序列中途更换为其他序列6，或将其截短至6–9 nt7,8。Wen和Gray9设计了一种无引物的基因组SELEX方法，在筛选前完全去除文库中的引物序列，随后再重新生成引物以实现对筛选出的基因组片段的扩增。然而，该技术需要构建一个独特的基因组文库，其多样性有限，且在多轮筛选后的再生依赖于线性再扩增步骤。另一种方法是利用高效分离技术来规避固定引物序列带来的问题，但该方法在PCR扩增方面仍面临挑战10。
我们开发了一种无引物（PF）筛选方法，该方法显著简化了SELEX流程，并有效消除了引物干扰问题11, 12。该实验方案操作简便：首先将文库的中心随机区域在去除无关侧翼序列后进行纯化，然后使其与合适的靶标结合（例如纯化的蛋白质或细胞系等复杂混合物）；接着回收结合的序列，重新连接侧翼序列并进行扩增，以生成被筛选的亚文库。作为示例，本文中我们针对黑色素瘤的蛋白标志物S100B筛选了适配体。经过几轮筛选后的结合实验显示，其解离常数（Kd）达到10-7 - 10-8 M范围，并且我们证明这些适配体在夹心结合模式中具有良好的功能效果。

SELEX 流程包含多轮筛选，每轮筛选都需要再生结合的配体，而配体再生又需要随机文库区域两侧带有固定的引物序列。这些固定的引物序列可能会干扰筛选过程（导致假阳性或假阴性）。本文介绍了一种无需引物的实验方案。

使用随机DNA文库进行无引物适配体筛选

适体是一类具有高度结构化的寡核苷酸（DNA 或 RNA），能够以与抗体相当的亲和力结合靶标1。它们通过……被鉴定出来

本实验的总体目标是从随机文库中鉴定出特异性结合靶蛋白（本例中为 S100B 蛋白）的抗体片段（abers）。该目标首先通过使用限制性内切酶消化文库，从而释放出位于两侧固定引物序列之间的随机序列来实现。实验的第二步是将这些随机文库序列与纯化的 S100B 蛋白结合，并进行回收。该实验步骤的第三步是通过杂交和连接，将已结合的序列与固定的引物序列重新连接。实验的最后一步是转录连接产物，以便对结合的候选抗体库进行逆转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）的再扩增，并进行后续多轮筛选。最终可获得结果，显示所选抗体对S100B蛋白具有特异性结合能力。例如，此处使用微阵列进行夹心结合测定，并使用功能化纳米线以及与15纳米金纳米颗粒偶联的二抗进行荧光标记的二抗测定。今天，我们将展示一种从随机D序列文库中筛选出可结合S hundred B蛋白的最优序列的实验流程。在我们的实验室中，该方法被用于多种用途，包括开发用于癌症早期检测的传感器平台。那么，让我们开始吧。首先，按照之前所述的方法构建一个无引物或PF DNA文库。将双链DNA文库进行切割后，使用10%变性聚丙烯酰胺凝胶进行胶纯化，将得到一个5'端带磷酸基团、长度为32个核苷酸的片段（30 cc）和一个5'端带磷酸基团、长度为30个核苷酸的片段（30），分别称为32+片段和30+片段。32 plus 片段包含30个核苷酸的随机区，并在3'端带有CC最小侧翼序列，而30 plus 片段仅包含30个核苷酸的随机区序列。为了制备用于aptr筛选的PF文库DNA片段，将32 plus和30 plus片段分别重悬于40微升20毫摩尔Tris-HCl（pH 7.4）中。随后将样品在85摄氏度加热3分钟，接着进行孵育。将样品在37摄氏度水浴培养箱中冷却3分钟，随后加入760微升筛选缓冲液，在37摄氏度下孵育3分钟。3分钟后，将样品在室温下静置10分钟。孵育结束后，将溶液通过预先用筛选缓冲液洗涤过的含镍NTA琼脂糖珠的层析柱。为去除非特异性 DNA，收集不结合到柱子上的 PF 文库 DNA 片段，并留待后续使用。为制备 S 100 B 结合珠，首先在微量离心机中将 400 微升镍 NDA 珠离心 3 秒，弃去上清液。然后用 400 微升结合缓冲液轻轻吹打 5 次以洗涤珠子。然后离心沉淀珠子并弃去上清液。重复此步骤，洗涤两次。接下来将先前纯化的带组氨酸标签的蛋白质过柱至珠子上。此处使用人S100钙结合蛋白B，轻轻吹打溶液，每3分钟上下吹打5次，共15分钟。15分钟后，离心磁珠并弃去上清液。最后，用400微升洗脱缓冲液轻轻吹打3次，洗涤磁珠结合的S 100 B。再次离心磁珠并弃去上清液。重复此步骤两次，共进行三次最终洗涤，以筛选出与S100B结合的抗体。取回先前保留的32+和30+片段，并将其加入与磁珠结合的S100B中。然后将样品孵育15分钟。15 分钟后，每隔 3 分钟轻轻吹打混匀一次，短暂离心使磁珠沉降，弃去上清液，然后用 800 µL 选择缓冲液轻轻吹打洗涤 S 100 BDNA 复合物。随后离心使磁珠沉降，弃去上清液。重复此洗涤步骤两次。为了回收 S 100，向珠子中加入 200 微升 20 毫摩尔的 Tris-HCl（pH 7.4）。然后将混合物在 85 摄氏度下加热三分钟。孵育后。将珠子涡旋震荡一分钟，然后离心沉降。接着将上清液转移至新的离心管中。重复此步骤一次，并合并上清液。最后，纯化所选的DNA片段。用等体积的苯酚-氯仿和异丙醇对PCR产物进行两次抽提。在-70°C条件下，加入250毫摩尔的氯化钠和2.5倍体积的100%乙醇，沉淀15分钟。在 4°C 条件下以 21,000 ×g 离心 15 分钟，然后弃去上清液。用 75% 乙醇充分洗涤沉淀。在4°C、21,000 ×g条件下离心5分钟，弃去上清液。在真空浓缩仪中将沉淀干燥3分钟。经过10轮筛选后，将PCR扩增得到的DNA片段克隆至购自Vitrogen Core的PCR 2.1 topo载体中。然后使用 M13 正向引物对每种选定的 N30cc 和 N30 片段分别测序 40 至 50 个单克隆。使用 Infomax Vector NTI 软件对选定的序列进行比对，随后根据比对结果确定共识序列。确定共识序列后，按照书面实验方案所述购买共识适配体。将第一个在5'端带有氨基己基修饰的适配体溶于打印缓冲液中，终浓度为15 µM。随后使用Apogen Discoveries MicroGrid阵列仪将适配体溶液点样至CodeLink活化载玻片上。按照代码链接推荐的方案操作。每张载玻片打印12个阵列，采用2×8格式。用于杂交的微阵列杂交盒。将S 100 B蛋白用70微升PBS稀释至适当浓度，然后将溶液加入微阵列杂交盒的孔中。使用无核酸酶的粘性封膜密封微阵列盒，以防止蒸发。让蛋白质结合到代码链接上印制的捕获探针。孵育后，在室温下单独孵育一小时。用含5毫摩尔氯化镁的磷酸盐缓冲液（PBSM）洗涤胶盒中的孔三次。接着，将荧光标记的第二抗体用70微升PBSM稀释至0.125微摩尔。将混合物在85摄氏度加热3分钟。然后将标记好的ABERS置于冰上冷却。将ABERS加入到微阵列盒的各孔中，孵育3分钟。再次用粘性箔膜密封盒体，并在室温下孵育1小时。再次单独操作。洗涤后用 PBSM 溶液洗涤各孔三次。拆卸盒式夹具，并用 PBSM 溶液冲洗整张载玻片。然后通过离心彻底干燥载玻片。最后，使用Packard Biosciences ScanArray扫描仪扫描载玻片。通过测定γ-³²P标记的五端标记适配体与S100B蛋白结合的情况，并根据浓度绘制结合曲线以确定KD值。经过大约七轮筛选后，典型的解离常数（kd）通常在10⁻⁷摩尔浓度范围内。将5'端修饰的dert-1适配体偶联至CodeLink微阵列，纯化的S100B蛋白与第一代适配体结合，随后加入LOR-546标记的第二代适配体，该适配体可结合已与S100B蛋白形成的复合物。使用扫描阵列仪对荧光进行定量。中间行显示了夹心结合，其特征是在上方和下方行中KD测定中表现出的加和性结合。对于5'巯基修饰的首个抗体，未观察到夹心结合；这些抗体通过标准巯基化学法偶联到金纳米线上。将第二种适配体以相同方式偶联到50个NMO或金纳米颗粒上。然后，纯化的S100B蛋白首先与衍生化纳米线结合，随后50纳摩尔的金纳米颗粒标记的第二适配体与第一适配体-纳米线-S100B复合物结合。利用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）对形成的夹心复合物进行观察。以 HTRA1 蛋白替代 S100B 蛋白进行结合实验时，可观察到阴性对照结果。需要注意的是，该实验方法的一个关键点在于采用了无引物的设计，即不使用固定的序列，从而避免因固定序列本身对随机区域产生压倒性影响而导致假阳性或假阴性结果。在进行该实验时，必须确保在每次逆转录反应之前彻底降解 DNA 模板，并在每次再扩增后小心分离出特异性的 RT-PCR 产物。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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生物学

引物的适体的选择，使用一个随机DNA文库

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