Name: 胞内相互作用的可视化和量化脑膜炎奈瑟菌和人类α-辅肌动蛋白共聚焦成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 学习利用共聚焦激光扫描显微镜和共定位软件，在人脑微血管内皮细胞中可视化和量化脑膜炎奈瑟菌与α-辅肌动蛋白的胞内相互作用。该方法为研究细菌致病机制提供了可靠的实验方案。

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本研究由惠康信托基金（Wellcome Trust）和英国脑膜炎基金会（Meningitis UK）资助。HBMEC 细胞系由 K.S. Kim 博士提供。共聚焦成像和电子显微镜实验在布里斯托大学的沃尔夫森生物成像中心（Wolfson Bioimaging Facility）完成。我们还要感谢布里斯托大学的 Alan Leard 先生、Mark Jepson 博士以及 PerkinElmer 公司的 Alan Tilley 先生提供的帮助与建议。

1. 免疫荧光实验方案
铺板、感染与免疫染色
以下操作步骤需要具备适当安全级别的组织培养和微生物学实验室设施。
第1天
A. 感染用靶细胞的制备
<ol>
	<li>将HBMEC以50%汇合度（约1.5×104 个细胞/cm2）接种于置于12孔板（每孔生长面积为3.8 cm2）中的玻璃盖玻片（直径16 mm）上。 生长培养基：RPMI 1640，添加15%热灭活（56 °C，30分钟）胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 U/mL青霉素/链霉素、1%（v/v）MEM非必需氨基酸溶液和1% MEM维生素溶液。</li>
	<li>在37°C、5% CO2培养箱中培养过夜（O/N）。</li>
</ol>
B. 细菌培养
<ol>
	<li>在所需培养基（例如补充10%加热马血的脑心浸液（BHI）琼脂平板）上，于37°C、5% CO2条件下培养目标菌株过夜（16–18小时）4。</li>
</ol>
第2天
A. 细菌（N. meningitidis）悬液的制备
<ol>
	<li>使用10 μL接种环，将过夜培养的细菌培养物悬浮于2 mL PBSB（含钙和镁的PBS）中。</li>
	<li>将悬浮液在室温（RT）静置5分钟，使较大的细菌聚集体沉降。</li>
	<li>在不扰动沉淀的前提下，将上层1 mL悬浮液（储备接种物）转移至无菌试管中。</li>
	<li>为估算储备接种物中的细菌数量，取等分试样（20–50 μL）加入含有1 mL 0.1 M NaOH中1% SDS的试管中，轻轻混匀以溶解细菌。</li>
	<li>通过测定260 nm处的吸光度（A260）来测定溶液中核酸含量。据我们实验经验，A260为1时相当于5×108 菌落形成单位/mL（cfu/mL）。可通过将储备接种物用PBSB进行系列稀释，涂布于琼脂平板，经过夜培养后计数菌落，以验证该换算关系。</li>
	<li>将储备接种物的等分试样用感染培养基［M199培养基添加2%去补体（56°C，30分钟）的正常人血清（NHS）］稀释，以获得感染靶细胞所需的细菌密度。
 <ol>
 	<li>在我们实验室中，通常采用每个靶细胞200–300个细菌的感染比例。</li>
	</ol>
 </li>
</ol>
B. 细胞培养感染
<ol>
	<li>用 Hank's 培养基将接种有靶细胞的盖玻片洗涤 3 次，以去除任何残留的抗生素。</li>
	<li>在 37°C、5%CO2 条件下，用新鲜制备的细菌悬液（如上所述）感染细胞 3 至 8 小时。</li>
	<li>感染结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，并在 500 μL 的 2% 多聚甲醛（PFA）中于室温固定 30–45 分钟，或于 4°C 过夜。
 <ol>
		<li>上述浓度和时间的多聚甲醛固定被证明适用于保持细菌和细胞形态。</li>
	</ol>
 </li>
	<li>去除多聚甲醛后，将固定好的细胞在含 0.1% Triton X-100 的 PBS 中孵育 10 分钟，以进行透化处理。</li>
	<li>用 PBS 将样品洗涤 3 次。</li>
	<li>随后进行免疫染色，或 alternatively 将样品置于 500 μL 的 1% BSA/PBST 中，于 4°C 过夜保存。</li>
</ol>
第3天
免疫染色
通过使用适当的一抗和二抗，可依次或同时对细胞内细菌和α-肌动蛋白进行染色，具体步骤如下：所有操作均可在12孔板中进行。
<ol>
	<li>用 500 μL 含 0.05% Triton X-100 的 3% BSA/PBST（PBS 缓冲液）在室温下封闭载玻片上的通透细胞，封闭时间为 30–60 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤后，将每张载玻片转移至 12 孔板中的一个新的干燥孔中。</li>
	<li>加入针对细菌和 α-肌动蛋白的初级抗体；每张载玻片加入 80 至 100 μL 抗体，小心滴加以完全覆盖载玻片表面即可。室温孵育 1 小时。
 <ol>
 	<li>我们同时使用了兔多克隆抗血清（实验室制备）针对 Neisseria meningitidis 以及小鼠单克隆抗体（mAb）针对 α-肌动蛋白（Abcam）。在某些实验中，以抗肌动蛋白或波形蛋白的单克隆抗体（Sigma）替代抗 α-肌动蛋白抗体。</li>
 </ol>
 </li>
	<li>孵育结束后，在孔中加入 200 μL PBS，小心提起载玻片并转移至含有 500 μL PBS 的新孔中。</li>
	<li>5 分钟后，用移液器吸除 PBS，然后加入新鲜 PBS。重复此洗涤步骤两次。将载玻片转移至新的干燥孔中。</li>
	<li>加入用 1% BSA/PBST 稀释的相应偶联不同荧光染料的二抗；室温避光孵育 1 小时。
 <ol>
		<li>用于细菌检测时，我们使用 TRITC 标记的抗兔 Ig 抗体；用于 α-肌动蛋白及其他细胞骨架蛋白检测时，我们使用 FITC（Sigma）或 Alexa Fluor 488（Invitrogen）标记的抗小鼠 Ig 抗体。</li>
 </ol>
 </li>
	<li>孵育结束后，按步骤 4 和 5 的方法进行洗涤。</li>
	<li>用含 0.6 μg/mL DAPI 的 PBS（DNA 染色剂）在室温避光条件下复染 5 分钟。</li>
	<li>用 PBS 漂洗。</li>
	<li>将载玻片（细胞面朝下）用一滴封片介质（例如 Mowiol 或 Vectashield）封固于载玻片上。</li>
	<li>置于 4°C 避光保存。</li>
	<li>样品可进行显微镜观察。</li>
</ol>
2. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）
为了观察和采集细胞内细菌及细胞骨架成分的图像，我们使用免疫标记的样品，并通过连接至Leica DM I6000倒置落射荧光显微镜的Leica SP5-AOBS共聚焦激光扫描显微镜采集图像。所有图像均采用63倍、数值孔径（NA）1.4的油浸物镜采集，并使用Leica软件进行处理。
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）操作步骤：
<ol>
	<li>开始共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）操作时，在物镜上滴加一滴浸油，并将样品载玻片盖玻片朝下放置于显微镜载物台上。</li>
	<li>将显微镜设置为明场观察模式，通过显微镜目镜找到感兴趣的区域。</li>
	<li>使用 Leica 软件，选择 xyz 采集模式。</li>
	<li>选择 512 x 512 格式（帧大小）。对于共定位研究，分辨率越高，图像越准确，但需考虑显微镜的分辨率极限。然后选择双向 X 扫描模式，以提高扫描速度并减少光漂白。</li>
	<li>设置逐层扫描参数。点击“seq”功能，并选择一种扫描模式。我们通常使用“线间扫描”模式。</li>
	<li>根据与二抗偶联的荧光染料选择相应的激光束：DAPI（蓝色）使用 405 nm，Alexa Fluor 488（绿色）使用 488 nm，TRITC（红色）使用 561 nm。分别激活光电倍增管（PMT）1、2 和 3，并调节 PMT 设置以检测正确的发射波长。</li>
	<li>设定 z 轴堆栈或序列的顶部（“起始”）和底部（“终止”）位置，然后设定所需的“z 轴步进大小”。
	<ol>
		<li>Neisseria meningitidis 是一种双球菌（见图1G），由于每个球菌的直径约为 0.5 μm，因此选择 0.20 μm 的 z 轴步进大小，以提高每个球菌至少被扫描两次的概率。该步进大小也处于最佳分辨率范围（0.1 - 0.2 μm）之内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过设置 3 次线平均来确定最终扫描参数，以提高信噪比。</li>
	<li>点击“开始”按钮，通过在不同波长下进行逐层扫描，获得双标或三标图像，从而消除不同发色团之间的串扰。</li>
	<li>为评估两种荧光染料的共定位情况，选择“叠加”功能将选定通道合并为单张图像；例如，当 Alexa 488（绿色）和 TRITC（红色）荧光染料发生共定位时，叠加图像中将呈现黄色。</li>
	<li>使用“最大投影”功能整合 z 轴堆栈或序列，生成用于观察可能共定位的二维图像。通过分析各个光学切片，可获得更详细的共定位信息。</li>
	<li>在获取 z 轴堆栈或序列后，对数据进行处理，生成正交图像，以可视化不同组分在细胞内的定位（见图1E）。</li>
</ol>
3. 共定位的定量分析
使用 Volocity 软件（Improvision, PerkinElmer）对共聚焦扫描显微镜图像进行统计分析。该软件提供了一种专门用于共定位分析的工具，该方法由 Manders 描述。 等(1993)5在数字荧光成像中，共定位是指在同一通道的相同体素（像素体积）位置检测到信号。这两个通道由来自同一样本区域的两种不同荧光染料的图像组成（Volocity 用户指南）。使用 Volocity 软件（Improvision, PerkinElmer）进行统计分析，具体采用如下所述的定量共定位分析方法。
定量共定位分析
<ol>
	<li>使用 Volocity 软件创建包含共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像的图像库。</li>
	<li>在顶部工具栏中选择“扩展聚焦”（extended focus）功能。该工具将 z 轴层叠图像合成为一幅二维图像以供分析。</li>
	<li>选择“共定位”（Colocalization）工具。待分析的两个通道应具有相同的颜色深度。</li>
	<li>选择需要定量的区域，并设置阈值以去除背景信号。</li>
	<li>通过选择“生成共定位”（generate colocalization）创建共定位输出结果。共定位统计结果将基于先前选定的兴趣区域生成。</li>
	<li>选择 Manders 系数 R（重叠系数）和 My（共定位系数）。
	<ol>
		<li>Manders 系数对染色强度不敏感，因其已对总像素强度进行了归一化处理；因此当一种抗原的染色强度明显强于另一种时，仍可使用该系数。</li>
		<li>根据 Manders5,6定义的重叠系数 R 反映了真实的共定位程度，即共定位的像素数量占总像素数量的比例。</li>
		<li>另一方面，共定位系数 My 描述了较丰富组分（本例中为 α-肌动蛋白，绿色）对较稀有组分（本例中为细菌，红色）的荧光贡献，即红色像素中与绿色像素重叠的部分占全部红色像素的比例。</li>
		<li>Manders 系数的取值范围为 1 至 0，其中 1 表示高度共定位，0 表示无共定位；但为便于解释，也可表示为百分比形式。</li>
	</ol>
 </li>
	<li>将统计数值导出至 Excel 文档，用于数据展示。</li>
</ol>
4. 代表性结果
表达 Opc 的细胞内定位 脑膜炎奈瑟菌 和α-肌动蛋白结合蛋白
对人脑微血管内皮细胞感染Nm 3小时和8小时后的共聚焦成像（如上所述）显示，α-肌动蛋白交联蛋白（α-actinin）与Nm存在共定位现象，该现象在感染3小时的实验中出现频率较低（未展示），而在感染8小时的培养物中更为明显（图1 A-F）。每次观察均发现α-actinin与表达Opc的脑膜炎奈瑟菌（meningococci）存在明显的共定位 &gt;5 次重复实验。使用多张共聚焦图像对共定位进行的统计分析按上述方法进行。总体而言，在感染表达 Opc 的脑膜炎奈瑟菌的 HBMEC 中， &gt;获得绿色（α-肌动蛋白）与红色（Nm）像素25%的重叠（图2B，重叠系数R）。与α-肌动蛋白不同，在对内化细菌以及肌动蛋白或波形蛋白进行标记的实验中，偶尔可观察到与肌动蛋白的共定位，而与波形蛋白的共定位则极为罕见（图2B）。
数据还通过系数 My 进行了分析，该系数考虑了每种组分的相对丰度。My 用于衡量每次丰度较低的信号（本例中为红色，细菌）出现时，丰度较高的信号（本例中为绿色，α-肌动蛋白）出现的频率。该指标显示，在内化脑膜炎奈瑟菌附近，α-肌动蛋白的出现频率显著升高（图 2A 和 C）。
<img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="共聚焦显微镜示意图，显示多色标记下的细胞结构和荧光标记物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 利用共聚焦激光扫描显微镜评估脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis）与α-辅肌动蛋白的细胞内相互作用。 A-H. 在盖玻片上生长的融合内皮单层细胞被表达Opc的（A-F）N. meningitidis感染。感染8小时后，洗去未黏附的细菌，用多聚甲醛固定细胞，并用0.1% Triton X-100进行透化处理。随后，按照上述方法对细菌和α-辅肌动蛋白进行染色（α-辅肌动蛋白，绿色；细菌，红色）。
A-C。一个视野显示了Nm（A）或α-肌动蛋白（B）的x-y图像位置。（C）中的叠加图像显示了多处呈现黄橙色的区域，提示存在共定位现象。（A）和（B）中的箭头指示了细菌周围出现大量α-肌动蛋白聚集的区域。
D. 对感染的HBMEC单层细胞进行光学切片，显示在细胞基底部的胞内细菌周围存在共定位现象。
同样，这种共定位并非由于α-辅肌动蛋白的偶然接近所致，因为该区域α-辅肌动蛋白的整体染色水平较低。
E 和 F。按照上述方法处理的感染HBMEC单层细胞的三维图像。倾斜视角下的顶端表面（E）显示黏附的细菌呈红色（红色箭头），而位于内皮细胞基底面附近的一些细菌（黄色箭头）则明显呈橙色/黄色。在（F）的端面X-Z截面图中，细菌的基底位置可更清晰地观察到。
N. meningitidis 的负染色电子显微镜图像，显示其主要呈双球菌形态。每个球菌的直径约为 0.5 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="蛋白质定位显微镜；α-辅肌动蛋白、波形蛋白、肌动蛋白；重叠系数、相对表达水平。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. α-辅肌动蛋白、肌动蛋白和波形蛋白在 HBMEC 细胞中的定位与分布。
A. 感染的HBMEC单层细胞经处理，处理方法如上文图注所述；除α-辅肌动蛋白外，部分盖玻片采用与α-辅肌动蛋白类似的方法用于检测肌动蛋白或波形蛋白。如上所示，α-辅肌动蛋白在多个被内化的细菌周围聚集（白色箭头）。波形蛋白和肌动蛋白未与细菌发生明显程度的共定位。标尺表示20 μm。
B. 和 C. 使用上述 Volocity 软件进行三次以上的实验，获得系数 R 和 My 的数值。

<ol><li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells%3B+the+role+of+integrins+in+apical+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li>
<li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells%3A+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li>
<li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li>
<li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li>
<li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

通过在感染后3小时和8小时，利用人脑微血管内皮细胞（HBMEC）检测细菌与细胞骨架蛋白α-肌动蛋白的共定位情况，探讨了内化表达Opc蛋白的脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）与α-肌动蛋白结合的可能性。共聚焦显微镜结果显示，脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）与α-肌动蛋白存在共定位现象。值得注意的是，尽管在3小时时细菌已被细胞内化，但此时与α-肌动蛋白的共定位信号较弱。细菌与细胞骨架蛋白的结合似乎需要更长的胞内滞留时间，因为在感染8小时后，大量细菌显示出与α-肌动蛋白明显密切的关联。α-肌动蛋白是一种多功能蛋白，细菌与该细胞骨架成分的相互作用可能对靶细胞功能产生重要影响，这正是当前研究的课题。
如上所述，共定位的定量分析需要精细的样品制备。应特别注意样品的固定、封闭时间以及抗体稀释度。为了获得最佳的信噪比，每种一抗和二抗都应在预实验中进行滴定，以确定最适浓度。根据我们的经验，使用Mowiol封片剂可获得更佳的成像效果。

<table><tbody><tr><td>12 孔板</td><td>康宁</td><td>BC311</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR international</td><td>631-0152</td><td></td></tr><tr><td>BHI 琼脂</td><td>LAB M</td><td>LAB048</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2154</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza Inc.</td><td>BE12-167E</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>HANK&amp;rsquo;S 平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWhittaker</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM维生素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>PBSB</td><td>Lonza Inc.</td><td>BE17-513F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9564</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;#8209;Nm 抗血清</td><td>实验室培育</td><td></td><td>兔血清</td></tr><tr><td>TRITC 抗兔 Ig</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6778</td><td></td></tr><tr><td>抗 &amp;alpha;&amp;#8209;α-肌动蛋白单克隆抗体 [7H6]</td><td>Abcam</td><td>Ab32816</td><td>IgG</td></tr><tr><td>抗肌动蛋白单克隆抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4700</td><td>IgG2a</td></tr><tr><td>抗波形蛋白单克隆抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6630</td><td>IgG1</td></tr><tr><td>ALEXA FLUOR 488 抗&amp;#8209;小鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;可视化并定量分析细菌进入人内皮细胞后与细胞内蛋白的共定位&quot;&gt;1. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）：&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Leica SP5 共聚焦成像系统：该系统通过结合使用声光可调滤光器（AOTF）和声光分光器（AOBS），简化了特定波长的激发光选择。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;可视化并定量分析细菌进入人内皮细胞后与细胞内蛋白的共定位&quot;&gt; 2-软件：&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt; Leica 共聚焦软件 LCS，Leica Microsystems，德国&lt;br/&gt;Volocity 5，Improvision，PerkinElmer，美国&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

neisseria meningitidis 与人类α-肌动蛋白结合蛋白的细胞内相互作用的共聚焦成像可视化与定量分析

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

脑膜炎奈瑟菌（Nm，脑膜炎球菌）的 Opc 蛋白是一种表达于表面的完整外膜蛋白，可作为黏附素和有效侵袭素，介导对人类上皮细胞和内皮细胞的侵袭。我们已鉴定出内皮细胞表面定位的整合素是 Opc 的主要受体，该过程需要 Opc 首先结合整合素配体（如玻璃粘连蛋白），再通过这些配体与细胞表达的受体结合1。此过程可导致细菌侵入内皮细胞2。最近，我们观察到 Opc 与人类细胞全细胞裂解液中一种 100 kDa 蛋白之间存在相互作用3。最初，我们在将电泳分离并转印至硝酸纤维素膜上的宿主细胞蛋白与表达 Opc 的 Nm 重叠孵育时，观察到该相互作用。该相互作用是直接的，不涉及中间分子。通过质谱分析，我们确定该蛋白为 α-辅肌动蛋白。由于在所检测的八种细胞系中均未发现表面表达的 α-辅肌动蛋白，且 Opc 在血清存在下与内皮细胞相互作用可导致细菌进入靶细胞，因此我们进一步探讨了这两种蛋白在细胞内相互作用的可能性。为此，我们用表达 Opc 的 Nm 长时间感染培养的人脑微血管内皮细胞（HBMECs），并通过共聚焦显微镜观察内化细菌与 α-辅肌动蛋白的定位情况。我们观察到，随着细菌内化时间的延长，Nm 与细胞骨架蛋白的共定位逐渐增加，在细菌内化 8 小时后共定位程度显著。此外，利用定量成像软件，我们能够获得 Nm 与 α-辅肌动蛋白及其他细胞骨架蛋白共定位的相对定量数据。本文介绍了一种在细菌进入人内皮细胞后，对细菌与细胞内蛋白共定位进行可视化和定量的实验方案，该方法同样适用于人上皮细胞。

Neisseria meningitidis（Nm）是一种仅感染人类的革兰氏阴性呼吸道病原体，能够与人类α-辅肌动蛋白结合。本文介绍了一种在细菌侵入人脑微血管内皮细胞（HBMECs）后，可视化细菌与细胞内α-辅肌动蛋白共定位的实验方案。

Neisseria meningitidis 与人类α-肌动蛋白结合蛋白的细胞内相互作用的共聚焦成像可视化与定量分析

脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm，脑膜球菌）的Opc蛋白是一种表达于表面的整合外膜蛋白，可作为黏附素和……

以下实验的总体目标是评估内化细菌——脑膜炎奈瑟菌（RIA Meningitidis）与细胞骨架蛋白α-辅肌动蛋白（Alpha Actinin）的共定位水平。首先，将培养的人脑微血管内皮细胞与过夜培养的细菌共孵育3至8小时，使细菌进入靶细胞。第二步，对含有胞内细菌的细胞进行洗涤、固定和通透处理，从而为后续对内化细菌及胞内α-辅肌动蛋白进行免疫染色做好准备。在完成共聚焦成像并应用共定位分析软件后，可观察到细胞内共定位的图像，并获得定量结果，结果显示表达 OPC 的 Meninga Croci 以及膜蛋白可特异性地与细胞内 α-辅肌动蛋白相互作用，该结论基于共聚焦显微镜观察及定量共定位分析得出。大家好，我是来自布里大学细胞分子医学系 Mata TI 教授实验室的 Isel Maria。今天我们将向您展示一种用于评估细胞内细菌与细胞骨架蛋白共定位水平，即共定位比率的实验方法。我们在实验室中采用此方法研究表达自膜蛋白OPC的菌丝体脑膜炎与细胞骨架蛋白α-肌动蛋白之间的相互作用。现在让我们开始吧。该工作必须在符合标准的安全实验室中进行。在免疫染色操作前两天，将目标细菌菌株接种于添加了10%加热马血的脑心浸液琼脂平板上。在免疫染色前一天，于37°C、5%二氧化碳环境中过夜培养。使用10 µL的接种环制备过夜细菌培养物的悬液。在 2 毫升 PBSB 中，将悬液于室温静置 5 分钟，使较大的细菌聚集体沉淀。随后，将上层 1 毫升悬液转移至无菌试管中，注意不要扰动沉淀。通过向含有 20 微升细菌悬液的两个小瓶中各加入 1 毫升 1% SDS 和 0.1 摩尔氢氧化钠，以溶解细菌，并颠倒试管以混匀。用于估算细菌数量。通过测定溶液的吸光度来测量核酸含量。在216处将细菌悬液用感染培养基调节至所需密度，以用于感染人脑微血管内皮细胞。用于免疫染色的人脑微血管内皮细胞（H-B-M-E-C-A）于两天前接种：将16毫米玻璃盖玻片放入12孔板的孔中，并在盖玻片上以50%融合度接种HBME细胞，于37摄氏度、5%二氧化碳气氛中培养过夜；次日进行后续操作。使用实验室 freshly prepared 的细菌悬液感染细胞。通常采用每靶细胞 200 至 300 个菌落形成单位的感染比例。感染结束后，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 3 至 8 小时。用 PBS 洗涤细胞三次，然后加入 500 微升 2% 多聚甲醛，在室温下固定 30 至 45 分钟。洗去多聚甲醛后，将细胞在 PBS 稀释的 0.1% Triton X-100 中孵育 10 分钟，以进行透化处理。最后用 PBS 洗涤样本三次，随后进行免疫染色，如图所示。接下来可同时进行细胞内细菌和 δ-辅肌动蛋白（dfor actinin）的染色。在12孔板中，每孔加入500微升含3% BSA-PBST的封闭液，将含有通透细胞的盖玻片于室温下封闭30至60分钟。用PBS洗涤后，将每片盖玻片转移至12孔板中的新干燥孔中，同时加入针对细菌和α-辅肌动蛋白的一抗抗体，每片盖玻片加入80至100微升抗体溶液即可，注意小心添加以完全覆盖盖玻片表面，于室温孵育1小时。孵育结束后，向孔中加入200微升PBS，轻轻提起盖玻片并将其转移至另一新孔中，该孔内含500微升PBS。5分钟后，用移液器吸除PBS，然后加入新鲜PBS。重复此洗涤步骤两次，再将盖玻片转移至新的干燥孔中。接下来，加入用1% B-S-A-P-B-S-T稀释的相应二抗（与不同的荧光染料偶联），室温避光孵育一小时。孵育结束后，按前述方法进行洗涤，然后用DPI在室温下避光对DNA进行复染，持续五分钟。此步孵育结束后，用PBS洗涤盖玻片一次，随后滴加一滴封片剂进行封片。封片后的盖玻片应避光保存，直至准备观察。在显微镜下，我们使用配备倒置落射荧光显微镜的共聚焦激光扫描显微镜观察并采集免疫标记样品的图像。开始共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）操作时，先在物镜上滴加一滴浸液，然后将带有盖玻片的样品置于显微镜载物台上并缓慢滑入到位；将显微镜设为明场观察模式，通过目镜找到感兴趣的区域。现在可以开始使用 Leica 软件。选择 XY Z 轴采集模式，并为共定位研究选择 5×12 乘以 5×12 的格式。分辨率越高，图像越准确。然后选择双向 X 模式，这将提高扫描速度并有助于减少光漂白。设置逐行扫描参数。点击 SEC 功能，然后在谱线之间进行选择。根据与二抗偶联的荧光染料选择激光束：DPI 选择 405 纳米，Alexa Fluor 488 选择 488 纳米，Alexa Fluor 561 选择 561 纳米。依次激活三光子显微镜的第一、第二和第三光电倍增管。设置Z轴扫描或序列的顶部和底部位置。接下来，将Z轴步进大小设为0.2微米。RIA Mencius 是一种双球菌，由于每个球菌的直径约为 0.5 微米，因此将 Z 轴步长设为 0.2 微米可提高每个球菌至少被扫描两次的概率。通过选择三次线平均以提高信噪比，并点击“开始”来设定最终扫描参数。通过在不同波长下依次扫描，并对每个通道采用“行间模式”消除不同发色团之间的串扰，从而获得双染或三染图像。为了显示两种荧光染料的共定位情况，请选择叠加功能，将选定的通道合并为单幅图像。例如，当 Alexa 488 与 trissy 荧光染料共定位时，叠加图像中会呈现黄色。为了可视化可能的共定位，需要进行二维重建，此时应使用最大投影功能整合 Z 轴层扫（Zed stack）或序列图像。在获取 Z 轴层扫或序列图像后，需对数据进行处理，生成正交图像，以可视化细胞内不同组分的定位情况。使用 IMP 公司提供的 Vol City 软件进行共定位的定量分析。首先创建一个包含共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像的库，然后从顶部工具栏的图像中选择“扩展焦点”功能。该工具将把多个 Z 轴层面整合为一幅 2D 图像用于分析。现在选择共定位（COLOCALIZATION）工具。待分析的两个通道应具有相同的色彩深度。选择将要进行定量的区域。设置阈值以去除任何背景。通过选择生成共定位来创建共定位输出。将针对先前选定的兴趣区域生成共定位统计结果。接下来，选择 Mander 系数 R 和 Ny。最后，将统计值导出至 Excel 文档以进行数据展示，此处显示的是人脑微血管内皮细胞感染脑膜炎奈瑟菌八小时后的代表性共聚焦成像结果，细菌的位置以红色显示。绿色箭头指示α-辅肌动蛋白的位置，显示在细菌周围有大量α-辅肌动蛋白聚集的区域。在此叠加图像中，多处呈现黄橙色区域，提示脑膜炎奈瑟菌与α-辅肌动蛋白存在共定位现象。在下一张图像中，对感染的H-B-M-E-C单层细胞进行光学切片，显示在细胞基底部的胞内细菌周围存在共定位现象。当对感染的H-B-M-E-C单层细胞进行三维成像处理后，从斜向视角观察其顶面，可见由红色箭头指示的达氏菌（Durant bacteria）呈红色荧光，多个细菌位于内皮细胞基底面附近，由黄色箭头指示。在该末端XZ截面图中，可更清晰地观察到呈明显橙黄色的基底区域定位。相比之下，在远端α-辅肌动蛋白（actinin）实验中，对内化细菌以及menton或肌动蛋白进行标记的结果显示，细菌与肌动蛋白偶有共定位，但在H-B-M-E-C细胞中与fermenting蛋白的共定位极为罕见。如先前实验所观察到的，Retin 蛋白聚集在多个被内吞的细菌周围，白色箭头指示了这些位置。数据还经过分析以获得相对重叠系数 R。根据 Manda 的定义，该系数代表真实的共定位程度（IE），即共定位的像素数与总像素数之比。在表达脑膜炎奈瑟菌的 OPC 感染的 H-B-M-E-C 细胞中，α-肌动蛋白、menting 蛋白和肌动蛋白的整体 NY 值显示，Retin 与脑膜炎奈瑟菌的重叠率超过 25%。系数Y用于衡量每次稀有脑膜炎球菌信号出现时，更丰富的肌动蛋白α信号发生的频率。该指标显示出在内化脑膜炎球菌附近α-辅肌动蛋白显著的出现水平。在本实验中，我们将向您展示如何对内化细菌与细胞骨架组分之间的相互作用进行可视化和定量分析。务必严格遵守固定和免疫染色操作流程，以保持结构的完整性并避免产生高背景信号。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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