胞内相互作用的可视化和量化脑膜炎奈瑟菌和人类α-辅肌动蛋白共聚焦成像

以下实验的总体目标是评估内化细菌 RIA 脑膜炎与细胞骨架蛋白 Alpha 肌动蛋白的共定位水平。这是通过用细菌培养过夜感染培养的人脑微血管细胞 3 到 8 小时以使细菌进入目标细胞来实现的。作为第二步，洗涤、固定和渗透具有细胞内细菌的细胞，为内化细菌和细胞内 α 肌动蛋白的免疫染色准备感染的培养物。

在共聚焦成像和共定位软件的应用之后，可以观察到细胞内共定位的图像并获得量化结果，显示表达 OPC 的 Meninga Croci 并且膜蛋白可以基于共聚焦显微镜观察和定量共定位分析与细胞内 α 肌动蛋白特异性相互作用。大家好，我是来自布里大学细胞分子医学系 Mata TI 实验室教授的 Isel Maria。今天我们将向您展示一个估计细胞内细菌与细胞骨架蛋白比率的 col 水平的程序。

我们在实验室中使用该程序来研究表达自身膜蛋白 OPC 的菌丝体脑膜炎与细胞骨架蛋白 α 肌动蛋白的相互作用。那么让我们开始吧。这项工作需要在适当的安全实验室中完成。

免疫染色程序前两天，在脑心脏输注时接种感兴趣的细菌染色。在免疫染色前一天，补充有 10% 加热马血的琼脂板在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳气氛中生长过夜。使用 10 微升培养环制备过夜细菌培养物的悬浮液。

在 2 mL PBSB 中，将悬浮液在室温下静置 5 分钟，以使大细菌聚集体沉淀。接下来，将顶部 1 毫升的悬浮液转移到无菌管中，不干扰沉淀 溶解细菌 将 1 毫升 1% SDS 0.1 摩尔氢氧化钠加入两个装有 20 微升细菌悬浮液的小瓶中，并倒置管子混合。估计细菌数量。

通过测定溶液的吸光度来测量核酸含量。在 216 根鹿角时，将细菌悬浮液调整到感染培养基中所需的密度，以感染人脑微血管内皮细胞。人脑微血管内皮细胞或 H-B-M-E-C-A 在免疫染色前两天接种，将 16 毫米玻璃盖玻片放入 12 孔板的孔中，并以 50% 汇合度接种 HBME 海，在盖玻片上，在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳气氛中孵育过夜第二天。

在我们的实验室中用新鲜制备的细菌悬浮液感染细胞。通常使用每个靶细胞 200 至 300 个集落形成单位的感染比率。感染期结束时，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育 3 到 8 小时。

用 PBS 洗涤细胞 3 次，并在室温下固定 500 微升 2% 对甲醛 30 至 45 分钟洗去对位甲醛后，在 PBS 稀释的 0.1%Triton X 100 中孵育 10 分钟，渗透对对醛固定的细胞进行渗透。最后，用 PBS 洗涤样品 3 次，然后如图所示进行免疫染色。接下来可以同时进行细胞内细菌和 dfor 肌动蛋白的染色。

在 12 孔板中，用 500 μL 3%B-S-A-P-B-S-T 封闭含有可渗透细胞的盖玻片 30 至 60 分钟。在室温下用 PBS 转印洗涤后，每个盖玻片放入 12 孔板中针对细菌和 α 肌动蛋白的一抗处的新干孔中，同时每个盖玻片 80 至 100 微升抗体就足够了，如果小心添加以覆盖盖玻片表面，在室温下孵育 1 小时孵育结束时， 向中加入 200 微升 PBS，充分提起盖玻片并将其放入含有 500 微升 PBS 的新孔中 5 分钟后，通过移液去除 PBS，然后加入新鲜的 PBS。重复两次，将盖玻片转移到新的干井中。

接下来，加入与以 1%B-S-A-P-B-S-T 稀释的不同荧光染料偶联的适当二抗，在室温下避光孵育 1 小时，孵育结束时洗涤，然后在室温下用 DPI 对 DNA 进行复染 5 分钟，在室温下避光，孵育结束时，在 PBS 中洗涤盖玻片一次，然后用一滴封片封片封片。中型安装的盖玻片应避光存放，直到准备好观察。在显微镜下，我们使用连接到倒置落射荧光显微镜的共聚焦激光扫描显微镜观察和捕获免疫标记样品的图像。

要从一滴浸入物镜开始 CLSM 程序并放置标本载玻片盖，滑到显微镜载物台上，将显微镜设置为可见模式并使用显微镜的目镜找到感兴趣的区域，我们现在准备好使用 Leica 软件。选择 XY zed 采集模式。选择 5 个 12 x 5 个 12 格式进行共定位研究。

分辨率越高，图像越准确。然后选择双向 X 模式，这将提高扫描速度并有助于减少照片漂白。设置顺序扫描设置。

在 SEC 函数中单击，然后在行之间进行选择。根据与二抗偶联的荧光染料选择激光束。DPI 为 4 0 5 纳米 对于 Alexa，为 Fluor 4 88 和 5 61 纳米。

对于 trixy，分别激活光电倍增管 1、2 和 3。设置 Z 堆栈或序列的顶部和底部。接下来，将 Zed 步长设置为 0.2 微米。

RIA 孟子是一个双聚体，由于每个核心的直径约为 0.5 微米，因此 0.2 微米的 Z 步长增加了每个核心组至少扫描两次的可能性。通过选择 3 的线平均来设置最终扫描参数，以单击 start（开始）来提高信噪比。通过对不同波长进行顺序扫描，并对每个通道使用线间模式来消除不同发色团之间的串扰，可以获得双染色或三染色图像。

有关两种荧光染料共定位的指示，请选择叠加功能以将所选通道合并为单个图像。例如，当 Alexa 4 88 和 trissy Fluor Chromes 共定位时，黄色将出现在叠加图像中，用于可视化可能的共定位所需的 2D 重建使用最大投影函数编译 Zed 堆栈或系列。采集 Z 堆栈或序列后，处理您的数据以获得正交图像，用于可视化各种元素的细胞内定位。

使用 IMP 提供的 Vol City 软件进行共定位的定量。要开始使用 CLSM 图像创建库，请从顶部栏中的图像中选择 extended focus。该工具将 Zacks 组合成 2D 图像进行分析。

现在选择 COLOCALIZATION 工具。要分析的两个通道应具有相同的颜色深度。选择要量化的区域。

设置阈值以删除任何背景。通过选择 generate colocalization （生成共定位） 来创建共定位输出。将为先前选择的感兴趣区域生成共定位统计。

接下来，选择 mander 的系数 R 和 ny。最后，将值导出或统计到 Excel 文档以进行数据演示，此处显示了感染脑膜鸡眼 8 小时的人脑内皮细胞的代表性共聚焦成像结果。细菌的位置以红色显示。

虽然 α 肌动蛋白的位置以绿色表示，但箭头表示细菌周围似乎发生了高度 α 肌动蛋白积累的区域。在此叠加图像中，有几个区域出现黄橙色，表明枕脑膜和 α 肌动蛋白之间的共定位。在下一张图片中，受感染的 H-B-M-E-C 单层的光学解剖表明位于细胞底部的细胞内细菌周围共定位。

当处理感染的 H-B-M-E-C 单层的三维图像时，顶端表面的斜视图显示红色的 Durant 细菌，由红色箭头表示，其中几种细菌位于内皮细胞的基底表面，由黄色箭头表示。在这个端部 XZ 横截面中可以更清楚地看到明显的橙色、黄色基部位置。与 Far相反，在进行内化细菌和芒顿或肌动蛋白标记的肌动蛋白实验中，肌动蛋白实验揭示了偶尔与肌动蛋白共定位，但很少与 H-B-M-E-C 细胞中的发酵共定位。

正如在之前的实验中观察到的，Retin 集中在白色箭头指示的几种内化细菌周围。还对数据进行了分析以获得相对重叠。系数 R，根据 Manda，代表共定位的真实程度 IE，共定位的像素数与感染表达脑膜炎球菌的 OPC 的 H-B-M-E-C 的 α 肌动蛋白、粘膜蛋白和肌动蛋白总体的像素总数和 NY 值相比，在脑膜炎球菌中获得了大于 25% 的缰绳重叠。

系数和 Y 是每次出现丰度较低的脑膜可可信号时，货币出现更丰富的 rein 信号的频率的量度。该测量显示 α 肌动蛋白在内化脑膜 cockeye 附近出现的惊人水平。我们只是向您展示如何在本实验中可视化和量化具有细胞骨架元件的内化细菌的引入。

重要的是要记住严格遵循固定和免疫茎方案，以保持结构的完整性并避免高背景。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。