Name: 在固定和活细胞，流式细胞仪测量钙蛋白酶活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 了解如何使用流式细胞术测量固定细胞和活细胞中的钙蛋白酶活性。该方法利用荧光底物BUC, LMC MAC检测钙蛋白酶活性变化，为白血病和淋巴瘤研究提供可靠的检测手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

由加拿大卫生研究院、加拿大白血病与淋巴瘤协会以及加拿大淋巴瘤基金会的资助支持。

准备试剂
注意：所有 PBS 均含有 Ca2+ 和 Mg2+
<ol>
 <li>检测试剂 
 将20μM 7-氨基-4-氯甲基香豆素、叔丁氧羰基-亮氨酸-甲硫氨酸酰胺（BOC-LM-CMAC）加入室温 PBS 中。每份细胞悬液需要 2mL 检测试剂。</li>
 <li>1% 多聚甲醛（固定细胞用） 
 用室温 PBS 稀释 4% 多聚甲醛储备液。每管 FACS 管中分装 1mL 1% 多聚甲醛。每种实验条件需要 3 支 FACS 管（例如：32Dkit、32Dkit + PD150606、32Dkit + PD98059 需要 9 支 FACS 管）</li>
 <li>PD150606（钙蛋白酶抑制剂） 
 用 DMSO 重悬 PD150606，终浓度为 100mM。本试剂及所有经其处理的细胞在实验全程需避光保存。</li>
 <li>PD98059（MEK1 抑制剂） 
 用 DMSO 重悬 PD98059，终浓度为 50mM。</li>
</ol>
准备细胞
<ol>
 <li>在 Opti-MEM 培养基中培养 32Dkit 细胞，培养基中添加 5% 胎牛血清、WEHI-3 上清液作为 IL-3 来源（或使用其他 IL-3 来源，如重组蛋白）、0.1% 2-巯基乙醇和抗生素，细胞密度维持在每毫升 5 × 105 至 1 × 106 个细胞。</li>
 <li>将 12 × 106 个 32Dkit 细胞分装至三个 15 mL Falcon 管中，每管 4 × 106 个细胞。</li>
 <li>在 15°C 下以 1000 RPM 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
 <li>吸除上清液，将细胞重悬于 2 mL 室温 PBS 中。</li>
 <li>向其中一份细胞悬液中加入 50 μM PD150606。用铝箔包裹 Falcon 管以避光，短暂涡旋后于室温避光孵育 20 至 30 分钟。</li>
 <li>向第二份细胞悬液中加入 20 μM PD98059。将细胞接种至 35 mm 组织培养皿中，在 37°C 孵育 2 小时。</li>
</ol>
固定细胞中的钙蛋白酶活性检测
<ol>
 <li>在样品与PD150606孵育的同时，开始对未经处理的样品进行钙蛋白酶活性检测。首先向每份细胞悬液中加入2 mL检测试剂。立即将1 mL细胞悬液与检测试剂的混合液加入预先准备好的含有1%多聚甲醛的FACS管中（对应0分钟时间点）。</li>
 <li>将细胞悬液与检测试剂在室温下孵育5分钟。然后取1 mL细胞悬液加入另一FACS管中，其中含有1 mL 1%多聚甲醛。</li>
 <li>继续将细胞悬液与检测混合物在室温下额外孵育5分钟。随后再取1 mL细胞悬液加入另一FACS管中，其中含有1 mL 1%多聚甲醛。</li>
 <li>对经抑制剂处理的32Dkit细胞重复上述钙蛋白酶活性检测步骤。</li>
 <li>将细胞在4°C避光条件下固定过夜。</li>
 <li>次日，在15°C下以1800 RPM离心5分钟收集细胞。</li>
 <li>吸除上清液，将细胞重悬于750 µL PBS中。将细胞置于冰上并避光保存。</li>
</ol>
获取固定细胞的数据
<ol>
 <li>使用 LSR II（BD Bioscience）分析细胞。设置 Lightwave Xcyte（UV）激光器的参数：激发波长 355 nm，激光功率 25 mW，底物和产物的发射波长分别为 405 nm 和 450 nm。底物和产物的带通滤光片分别为 405/20 和 450/50，长通滤光片分别为 405 和 450。底物和产物的 PMT 电压分别设置为 350–375 和 325–350。</li>
 <li>在 BD FACSDiva 软件中设置实验参数：前向散射光；侧向散射光；Indo-1 蓝色（对数）；Indo-1 紫色（对数）。在工作表中设置以下图形：前向散射光与侧向散射光的点图，并在活细胞上设门（图 1a），Indo-1 蓝色直方图，Indo-1 紫色直方图，Indo-1 蓝色与 Indo-1 紫色的点图。</li>
 <li>使用 AlignFlow 和 AlignFlow plus 荧光微球（Invitrogen）对 LSR II 进行校准。每次实验前应调整 PMT 电压，使微球荧光直方图的峰值位于相同的通道。</li>
 <li>从 0 分钟时间点开始，使用 32Dkit 细胞采集数据。根据需要调整参数电压。每份样品采集并记录 10,000 个事件。</li>
 <li>对每份样品重复采集，在每管之间用 FACS 缓冲液冲洗仪器。</li>
 <li>导出数据。确保按照机构指南清洁 LSR II 仪器。</li>
</ol>
活细胞中钙蛋白酶活性检测
<ol>
 <li>按上述方法制备细胞悬液，但不加入PD150606。将样品转移至LSR II流式细胞仪，按上述设置滤光片和参数。按上述方法设置工作表。包含一个显示Indo-1 Blue与时间关系的大型点图。将程序设置为采集最大数量的事件（无停止门控）。</li>
 <li>向一份32Dkit细胞悬液中加入50μM PD150606。将样品避光保存，在室温下孵育20-30分钟。</li>
 <li>开始采集未添加PD150606的32Dkit细胞悬液数据。使用较低流速，每秒200-300个事件。在采集30秒至1分钟后，将样品管从仪器中取出。向细胞中加入20μM BOC-LM-CMAC，短暂涡旋混匀后继续采集数据。</li>
 <li>持续采集数据10-20分钟，或直至钙蛋白酶活性达到平台期。</li>
 <li>对经PD150606处理的32Dkit细胞重复步骤3和4。</li>
 <li>导出数据。确保按照机构指南清洁LSR II流式细胞仪。</li>
</ol>
复杂（混合）细胞群体中的钙蛋白酶活性检测
*本实验将鉴定从小鼠脾脏提取的细胞悬液中的32Dkit细胞。
<ol>
 <li>取出每只小鼠的脾脏。在室温下用 NH4Cl 裂解红细胞 10 分钟。</li>
 <li>在 2 mL PBS 中制备单细胞悬液。</li>
 <li>将每份细胞悬液分为两份。其中一份用 50 μM PD150606 在室温避光处理 20–30 分钟。</li>
 <li>按照上述“固定细胞中钙蛋白酶活性检测”（步骤 1–6）的操作继续进行。</li>
 <li>吸去上清液。用 500 μL PBS 洗涤细胞，吸去上清液。</li>
 <li>将细胞重悬于含 2% BSA 的 200 μL 染色缓冲液中，在室温孵育 15 分钟。</li>
 <li>配制一抗（FITC 标记的抗小鼠 CD117 抗体），使用染色缓冲液按 1:200 稀释。确保抗体避光保存。</li>
 <li>向细胞中加入 200 μL 一抗，在室温避光孵育 30 分钟。</li>
 <li>加入 400 μL PBS 以增加体积，用于流式细胞术检测。将细胞置于冰上并避光保存。</li>
 <li>按照“固定细胞数据采集”部分所述步骤操作。在检测参数中添加 FITC，并在工作表中包含 FITC 的直方图。</li>
</ol>
分析与代表性结果
<ol>
 <li>使用 FlowJo (Treestar) 分析数据。根据前向散射和侧向散射图谱对活细胞设门（图 1a）。从活细胞门中确定 Indo-Blue 的平均荧光强度（图 1b）。</li>
 <li>a) 对于混合细胞群体
 <ul>
 <li>在直方图和点图中使用 FITC 荧光识别 32Dkit 细胞群</li>
 <li>确定 32Dkit 细胞群 Indo-Blue 的平均荧光强度</li>
 </ul>
 </li>
 <li>使用 Microsoft Excel 绘制平均荧光强度曲线（图 2a）。计算 5 至 10 分钟之间直线的斜率。以柱状图形式绘制斜率，以评估细胞中钙蛋白酶活性（图 2b）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="流式细胞术示意图；基于前向散射和侧向散射的活细胞群体分布分析图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1a"> 
 图 1a. 基于前向散射和侧向散射特征确定活细胞。
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="流式细胞术结果，Indo-1染色细胞分析，分布直方图，数据比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1b"> 
 图1b. 10分钟时间过程中平均荧光强度的变化。
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="显示加入与未加入PD150606抑制剂时随时间变化的生化反应的折线图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2a"> 
 图 2a. 平均荧光强度的代表性图谱。
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="钙蛋白酶活性柱状图，32Dkit细胞在抑制剂PD150606、PD98059作用下的实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2b"> 
 图2b. 32Dkit细胞中加入抑制剂后的钙蛋白酶活性。

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本视频方案中测定了固定和活体32Dkit细胞中的钙蛋白酶活性。使用钙蛋白酶抑制剂PD150606处理该细胞系，可完全抑制细胞中的钙蛋白酶活性。此外，使用MEK1抑制剂PD98059处理也能完全抑制细胞中的钙蛋白酶活性。ERK是钙蛋白酶-2的主要激活因子3。这些结果表明，钙蛋白酶-2的活性在32Dkit细胞中占主导地位。本实验室目前的研究正在探讨钙蛋白酶活性升高在白血病中的影响，以及钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2在其中所起的作用。
本方案详细介绍了首个基于流式细胞术的检测方法，用于测定固定细胞和活细胞中钙蛋白酶的活性水平，可用于在完整细胞中研究钙蛋白酶的调控机制及其在病理过程中的作用。
该方案可进行修改，以检测抑制剂或基因操作对钙蛋白酶活性的影响。此外，该检测方法可用于测量脐血等复杂细胞混合物中的钙蛋白酶活性，或用于鉴定和测量从脾脏分离的特定细胞亚群中的钙蛋白酶活性。
该检测方法无法区分由不同钙蛋白酶异构体产生的活性。可使用基因或药物试剂敲低或抑制特...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4% 多聚甲醛</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;将4 g多聚甲醛溶解于100 mL PBS中。在通风橱中加热样品并搅拌至澄清。&lt;br/&gt;冷却后于4℃保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>使用 freshly reconstituted PD150606 以实现最大程度的钙蛋白酶抑制。</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>细胞信号技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow，AlignFlow 加荧光微珠 FACS 管</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;WEHI-3 细胞的上清液在本实验中用作白细胞介素-3（IL-3）的来源。每次收集的 WEHI-3 上清液均需进行滴定，以确定用于 32Dkit 细胞生长的最佳浓度。 </td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术测量固定和活细胞中的钙蛋白酶活性

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

钙蛋白酶是一类普遍存在的细胞内钙离子敏感性中性半胱氨酸蛋白酶1钙蛋白酶在多种生理过程中发挥关键作用，包括信号转导、细胞骨架重塑、基因表达调控、细胞凋亡以及细胞周期进程1钙蛋白酶已被证实在多种病理过程中发挥作用，包括肌营养不良症、癌症、糖尿病、阿尔茨海默病和多发性硬化症1. 钙蛋白酶的调控机制复杂且尚未完全阐明。mRNA 和蛋白质水平与钙蛋白酶活性的相关性较差，这限制了基因或蛋白质表达技术在检测钙蛋白酶活性中的应用。本视频方案详细介绍了我们实验室开发的一种流式细胞术检测方法，用于测定固定细胞和活细胞中的钙蛋白酶活性。该方法利用荧光底物 BOC-LM-CMAC，该底物可被钙蛋白酶特异性切割，从而实现对钙蛋白酶活性的检测。2在本视频中，使用 LSRII（BD Bioscience）检测固定或活体的小鼠 32Dkit 白血病细胞（单独存在或作为脾细胞群体的一部分）中的钙蛋白酶活性。结果显示，与正常的脾细胞相比，32Dkit 细胞的钙蛋白酶活性升高。

本文将详细介绍使用流式细胞术在固定细胞和活细胞中检测钙蛋白酶活性的实验方案。

钙蛋白酶是一类普遍存在的细胞内钙离子敏感性中性半胱氨酸蛋白酶¹。钙蛋白酶在多种生理过程中发挥关键作用，……

钙蛋白酶是一类广泛存在的、对细胞内钙离子敏感的中性半胱氨酸蛋白酶，在多种生理过程中发挥关键作用，包括信号转导、细胞骨架重塑、基因表达调控、细胞凋亡以及细胞周期进程。为检测固定细胞和活细胞中的钙蛋白酶活性，可加入荧光底物BUC, LMC MAC。该底物可被钙蛋白酶特异性切割，导致荧光信号增强。通过流式细胞术监测荧光变化，结果显示，与正常细胞相比，30 2D kit细胞中钙蛋白酶活性升高。大家好，我是 Christina Farr，来自多伦多大学免疫学系及大学健康网络 Stewart Berger 博士实验室。今天我将向大家展示如何利用基于流式细胞术的检测方法，在固定和活细胞中测量钙蛋白酶（calpain）活性。我们实验室使用该检测方法来研究白血病和淋巴瘤细胞中的钙蛋白酶活性。那么我们开始吧。在开始实验之前，准备好所需的试剂，包括检测试剂1%多聚甲醛、钙调蛋白抑制剂PD 1500606以及MEK1抑制剂PD 98059。有关这些试剂的配制细节，请参见随附的书面实验方案。向每支离心管中加入一毫升1%多聚甲醛。本视频中每个实验条件需要三支流式管用于固定细胞。共测试三个条件，因此需要九支流式管。使用32 dki细胞开始实验，细胞密度为每毫升0.5至1 × 10⁶个细胞，使用最佳培养基培养。加入胎牛血清、IL-3、肿瘤捕获乙醇及抗生素。将四乘以十的六次方个细胞转移至三个15毫升Falcon管中，每管各一。将管子放入离心机，在15摄氏度下以225 ×g离心5分钟，使细胞成团。离心后弃去上清液，用2毫升室温磷酸盐缓冲液重悬细胞，取一份细胞悬液加入50微摩尔的钙蛋白酶抑制剂PD 150606。用铝箔包裹管子以避光保护样品。短暂涡旋后，在室温避光孵育20至30分钟。用20微摩尔的MEK抑制剂PD 9059处理第二份细胞悬液。将细胞接种至35毫米的组织培养皿中，在37摄氏度下孵育2小时，同时对未处理的样品开始进行钙蛋白酶（Calpain）活性检测。首先，向细胞悬液中加入两毫升检测试剂。立即将一毫升细胞悬液与检测试剂的混合物加入预先准备好的离心管中，以制备时间为零（T=0）的样品。将细胞悬液与检测试剂混合后孵育五分钟。在室温下，将 1 毫升细胞悬液检测试剂混合物加入预先准备好的含 1 毫升 1% 多聚甲醛的离心管中，制备 T 等于 5 的样本。将剩余的细胞悬液继续在室温下与检测试剂混合物共同孵育额外 5 分钟。5 分钟后，将另一毫升细胞悬液转移至已准备好的含 1 毫升 1% 多聚甲醛的离心管中。这是 T 等于 10 分钟的时间点。接下来，在经抑制剂处理的 30 个 2D kit 细胞上重复钙蛋白酶活性检测。用铝箔覆盖支架。于4°C避光条件下固定细胞过夜，次日。在15°C下以725 × g离心5分钟，使细胞沉淀。离心后吸除上清液，然后将细胞重悬于750 µL PBS中。将细胞置于冰上

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在固定和活细胞，流式细胞仪测量钙蛋白酶活性

本视频展示了使用抗体对神经元细胞的线粒体呼吸链复合物、线粒体DNA相关蛋白以及线粒体外膜蛋白进行标记，随后通过流式细胞术定量其表达水平。...

使用流式细胞术测量神经元中的多个线粒体参数

细胞内 Ca2+ 动态变化在精子生理学中具有重要意义，而 Ca2+ 敏感染料则为研究这些变化提供了多功能工具。通过群体实验（荧光测定法和停流荧光测定法）和单细胞实验（流式细胞术和单细胞成像），可用于追踪人精子细胞中时空性的 [Ca2+]...

使用四种技术测量人类精子细胞内 Ca2+ 的变化：常规荧光测定法、停流荧光测定法、流式细胞术和单细胞成像

本方案描述了一种灵敏的基于细胞的细胞毒性检测方法。通过计数在效应CD8+ T细胞数量递增的情况下，存活的靶CD4+ T细胞频率的减少，该检测可直接评估抗原特异性CD8+...

基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

钙参与多种生理和病理生理信号通路。活细胞成像需要专门的设备，且耗时较长。本研究优化了一种快速、简便的方法，利用流式细胞仪检测悬浮状态下的贴壁上皮细胞胞质钙的相对变化。...

通过流式细胞术测量肾上皮细胞中的胞质钙离子浓度

遗传性心律失常通常由突变引起，这些突变会改变一种或多种离子通道在细胞表面的递送。本文中，我们改进了流式细胞术检测方法，用于定量分析在tsA-201细胞中表达的重组离子通道的总蛋白和细胞表面蛋白的相对表达水平。...

利用流式细胞术测定重组离子通道的细胞表面相对表达量与总表达量

线粒体自噬（mitophagy）是指线粒体的选择性降解过程，在维持线粒体稳态中发挥重要作用，并在多种人类疾病中出现调控异常。然而，目前可用于检测线粒体自噬活性的实验方法十分有限。本文中，我们提供了一种基于流式细胞术的高灵敏度检测方法，用于测量线粒体自噬活性。...

利用pH依赖性荧光报告基因mt-Keima通过流式细胞术灵敏检测线粒体自噬

胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对于维持机体稳态至关重要，该过程依赖于一系列受体和信号通路，以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。...

通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

实时流式细胞术具有单细胞灵敏度，特别适用于定量活体培养物中多模态受体的功能。利用成年神经前体细胞，通过钙离子指示染料检测钙离子内流、溴化乙锭摄取检测跨膜孔道形成，以及使用荧光乳胶微球检测吞噬作用，对P2X7受体功能进行了评估。...

实时活细胞流式细胞术研究成年神经前体细胞中P2X7受体介导的钙离子内流、孔道形成及吞噬作用

本文介绍了一组用于表征蛋白质与细胞或微囊泡膜相互作用的方法。...

使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微囊泡的相互作用

本实验方案描述了两种通过荧光底物结合流式细胞术或荧光分光光度计来检测caspase活性的方法。...

使用荧光定量法或流式细胞术检测Caspase活性

本文介绍了一种定量检测酵母样品在胁迫后存活率的实验方案。该检测方法采用两种荧光染料SYTO...

一种优化的LIVE/DEAD染色联合流式细胞术用于定量酵母细胞应激后的存活率

了解如何使用流式细胞术测量固定细胞和活细胞中的钙蛋白酶活性。该方法利用荧光底物BUC, LMC MAC检测钙蛋白酶活性变化，为白血病和淋巴瘤研究提供可靠的检测手段。

通过流式细胞术测量固定和活细胞中的钙蛋白酶活性

探索更多视频