Name: 在固定和活细胞，流式细胞仪测量钙蛋白酶活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 了解如何使用流式细胞术测量固定细胞和活细胞中的钙蛋白酶活性。该方法利用荧光底物BUC, LMC MAC检测钙蛋白酶活性变化，为白血病和淋巴瘤研究提供可靠的检测手段。

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由加拿大卫生研究院、加拿大白血病与淋巴瘤协会以及加拿大淋巴瘤基金会的资助支持。

准备试剂
注意：所有 PBS 均含有 Ca2+ 和 Mg2+
<ol>
 <li>检测试剂 
 将20μM 7-氨基-4-氯甲基香豆素、叔丁氧羰基-亮氨酸-甲硫氨酸酰胺（BOC-LM-CMAC）加入室温 PBS 中。每份细胞悬液需要 2mL 检测试剂。</li>
 <li>1% 多聚甲醛（固定细胞用） 
 用室温 PBS 稀释 4% 多聚甲醛储备液。每管 FACS 管中分装 1mL 1% 多聚甲醛。每种实验条件需要 3 支 FACS 管（例如：32Dkit、32Dkit + PD150606、32Dkit + PD98059 需要 9 支 FACS 管）</li>
 <li>PD150606（钙蛋白酶抑制剂） 
 用 DMSO 重悬 PD150606，终浓度为 100mM。本试剂及所有经其处理的细胞在实验全程需避光保存。</li>
 <li>PD98059（MEK1 抑制剂） 
 用 DMSO 重悬 PD98059，终浓度为 50mM。</li>
</ol>
准备细胞
<ol>
 <li>在 Opti-MEM 培养基中培养 32Dkit 细胞，培养基中添加 5% 胎牛血清、WEHI-3 上清液作为 IL-3 来源（或使用其他 IL-3 来源，如重组蛋白）、0.1% 2-巯基乙醇和抗生素，细胞密度维持在每毫升 5 × 105 至 1 × 106 个细胞。</li>
 <li>将 12 × 106 个 32Dkit 细胞分装至三个 15 mL Falcon 管中，每管 4 × 106 个细胞。</li>
 <li>在 15°C 下以 1000 RPM 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
 <li>吸除上清液，将细胞重悬于 2 mL 室温 PBS 中。</li>
 <li>向其中一份细胞悬液中加入 50 μM PD150606。用铝箔包裹 Falcon 管以避光，短暂涡旋后于室温避光孵育 20 至 30 分钟。</li>
 <li>向第二份细胞悬液中加入 20 μM PD98059。将细胞接种至 35 mm 组织培养皿中，在 37°C 孵育 2 小时。</li>
</ol>
固定细胞中的钙蛋白酶活性检测
<ol>
 <li>在样品与PD150606孵育的同时，开始对未经处理的样品进行钙蛋白酶活性检测。首先向每份细胞悬液中加入2 mL检测试剂。立即将1 mL细胞悬液与检测试剂的混合液加入预先准备好的含有1%多聚甲醛的FACS管中（对应0分钟时间点）。</li>
 <li>将细胞悬液与检测试剂在室温下孵育5分钟。然后取1 mL细胞悬液加入另一FACS管中，其中含有1 mL 1%多聚甲醛。</li>
 <li>继续将细胞悬液与检测混合物在室温下额外孵育5分钟。随后再取1 mL细胞悬液加入另一FACS管中，其中含有1 mL 1%多聚甲醛。</li>
 <li>对经抑制剂处理的32Dkit细胞重复上述钙蛋白酶活性检测步骤。</li>
 <li>将细胞在4°C避光条件下固定过夜。</li>
 <li>次日，在15°C下以1800 RPM离心5分钟收集细胞。</li>
 <li>吸除上清液，将细胞重悬于750 µL PBS中。将细胞置于冰上并避光保存。</li>
</ol>
获取固定细胞的数据
<ol>
 <li>使用 LSR II（BD Bioscience）分析细胞。设置 Lightwave Xcyte（UV）激光器的参数：激发波长 355 nm，激光功率 25 mW，底物和产物的发射波长分别为 405 nm 和 450 nm。底物和产物的带通滤光片分别为 405/20 和 450/50，长通滤光片分别为 405 和 450。底物和产物的 PMT 电压分别设置为 350–375 和 325–350。</li>
 <li>在 BD FACSDiva 软件中设置实验参数：前向散射光；侧向散射光；Indo-1 蓝色（对数）；Indo-1 紫色（对数）。在工作表中设置以下图形：前向散射光与侧向散射光的点图，并在活细胞上设门（图 1a），Indo-1 蓝色直方图，Indo-1 紫色直方图，Indo-1 蓝色与 Indo-1 紫色的点图。</li>
 <li>使用 AlignFlow 和 AlignFlow plus 荧光微球（Invitrogen）对 LSR II 进行校准。每次实验前应调整 PMT 电压，使微球荧光直方图的峰值位于相同的通道。</li>
 <li>从 0 分钟时间点开始，使用 32Dkit 细胞采集数据。根据需要调整参数电压。每份样品采集并记录 10,000 个事件。</li>
 <li>对每份样品重复采集，在每管之间用 FACS 缓冲液冲洗仪器。</li>
 <li>导出数据。确保按照机构指南清洁 LSR II 仪器。</li>
</ol>
活细胞中钙蛋白酶活性检测
<ol>
 <li>按上述方法制备细胞悬液，但不加入PD150606。将样品转移至LSR II流式细胞仪，按上述设置滤光片和参数。按上述方法设置工作表。包含一个显示Indo-1 Blue与时间关系的大型点图。将程序设置为采集最大数量的事件（无停止门控）。</li>
 <li>向一份32Dkit细胞悬液中加入50μM PD150606。将样品避光保存，在室温下孵育20-30分钟。</li>
 <li>开始采集未添加PD150606的32Dkit细胞悬液数据。使用较低流速，每秒200-300个事件。在采集30秒至1分钟后，将样品管从仪器中取出。向细胞中加入20μM BOC-LM-CMAC，短暂涡旋混匀后继续采集数据。</li>
 <li>持续采集数据10-20分钟，或直至钙蛋白酶活性达到平台期。</li>
 <li>对经PD150606处理的32Dkit细胞重复步骤3和4。</li>
 <li>导出数据。确保按照机构指南清洁LSR II流式细胞仪。</li>
</ol>
复杂（混合）细胞群体中的钙蛋白酶活性检测
*本实验将鉴定从小鼠脾脏提取的细胞悬液中的32Dkit细胞。
<ol>
 <li>取出每只小鼠的脾脏。在室温下用 NH4Cl 裂解红细胞 10 分钟。</li>
 <li>在 2 mL PBS 中制备单细胞悬液。</li>
 <li>将每份细胞悬液分为两份。其中一份用 50 μM PD150606 在室温避光处理 20–30 分钟。</li>
 <li>按照上述“固定细胞中钙蛋白酶活性检测”（步骤 1–6）的操作继续进行。</li>
 <li>吸去上清液。用 500 μL PBS 洗涤细胞，吸去上清液。</li>
 <li>将细胞重悬于含 2% BSA 的 200 μL 染色缓冲液中，在室温孵育 15 分钟。</li>
 <li>配制一抗（FITC 标记的抗小鼠 CD117 抗体），使用染色缓冲液按 1:200 稀释。确保抗体避光保存。</li>
 <li>向细胞中加入 200 μL 一抗，在室温避光孵育 30 分钟。</li>
 <li>加入 400 μL PBS 以增加体积，用于流式细胞术检测。将细胞置于冰上并避光保存。</li>
 <li>按照“固定细胞数据采集”部分所述步骤操作。在检测参数中添加 FITC，并在工作表中包含 FITC 的直方图。</li>
</ol>
分析与代表性结果
<ol>
 <li>使用 FlowJo (Treestar) 分析数据。根据前向散射和侧向散射图谱对活细胞设门（图 1a）。从活细胞门中确定 Indo-Blue 的平均荧光强度（图 1b）。</li>
 <li>a) 对于混合细胞群体
 <ul>
 <li>在直方图和点图中使用 FITC 荧光识别 32Dkit 细胞群</li>
 <li>确定 32Dkit 细胞群 Indo-Blue 的平均荧光强度</li>
 </ul>
 </li>
 <li>使用 Microsoft Excel 绘制平均荧光强度曲线（图 2a）。计算 5 至 10 分钟之间直线的斜率。以柱状图形式绘制斜率，以评估细胞中钙蛋白酶活性（图 2b）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="流式细胞术示意图；基于前向散射和侧向散射的活细胞群体分布分析图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1a"> 
 图 1a. 基于前向散射和侧向散射特征确定活细胞。
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="流式细胞术结果，Indo-1染色细胞分析，分布直方图，数据比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1b"> 
 图1b. 10分钟时间过程中平均荧光强度的变化。
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="显示加入与未加入PD150606抑制剂时随时间变化的生化反应的折线图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2a"> 
 图 2a. 平均荧光强度的代表性图谱。
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="钙蛋白酶活性柱状图，32Dkit细胞在抑制剂PD150606、PD98059作用下的实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2b"> 
 图2b. 32Dkit细胞中加入抑制剂后的钙蛋白酶活性。

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本视频方案中测定了固定和活体32Dkit细胞中的钙蛋白酶活性。使用钙蛋白酶抑制剂PD150606处理该细胞系，可完全抑制细胞中的钙蛋白酶活性。此外，使用MEK1抑制剂PD98059处理也能完全抑制细胞中的钙蛋白酶活性。ERK是钙蛋白酶-2的主要激活因子3。这些结果表明，钙蛋白酶-2的活性在32Dkit细胞中占主导地位。本实验室目前的研究正在探讨钙蛋白酶活性升高在白血病中的影响，以及钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2在其中所起的作用。
本方案详细介绍了首个基于流式细胞术的检测方法，用于测定固定细胞和活细胞中钙蛋白酶的活性水平，可用于在完整细胞中研究钙蛋白酶的调控机制及其在病理过程中的作用。
该方案可进行修改，以检测抑制剂或基因操作对钙蛋白酶活性的影响。此外，该检测方法可用于测量脐血等复杂细胞混合物中的钙蛋白酶活性，或用于鉴定和测量从脾脏分离的特定细胞亚群中的钙蛋白酶活性。
该检测方法无法区分由不同钙蛋白酶异构体产生的活性。可使用基因或药物试剂敲低或抑制特...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4% 多聚甲醛</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;将4 g多聚甲醛溶解于100 mL PBS中。在通风橱中加热样品并搅拌至澄清。&lt;br/&gt;冷却后于4℃保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>使用 freshly reconstituted PD150606 以实现最大程度的钙蛋白酶抑制。</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>细胞信号技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow，AlignFlow 加荧光微珠 FACS 管</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;WEHI-3 细胞的上清液在本实验中用作白细胞介素-3（IL-3）的来源。每次收集的 WEHI-3 上清液均需进行滴定，以确定用于 32Dkit 细胞生长的最佳浓度。 </td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术测量固定和活细胞中的钙蛋白酶活性

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

钙蛋白酶是一类普遍存在的细胞内钙离子敏感性中性半胱氨酸蛋白酶1钙蛋白酶在多种生理过程中发挥关键作用，包括信号转导、细胞骨架重塑、基因表达调控、细胞凋亡以及细胞周期进程1钙蛋白酶已被证实在多种病理过程中发挥作用，包括肌营养不良症、癌症、糖尿病、阿尔茨海默病和多发性硬化症1. 钙蛋白酶的调控机制复杂且尚未完全阐明。mRNA 和蛋白质水平与钙蛋白酶活性的相关性较差，这限制了基因或蛋白质表达技术在检测钙蛋白酶活性中的应用。本视频方案详细介绍了我们实验室开发的一种流式细胞术检测方法，用于测定固定细胞和活细胞中的钙蛋白酶活性。该方法利用荧光底物 BOC-LM-CMAC，该底物可被钙蛋白酶特异性切割，从而实现对钙蛋白酶活性的检测。2在本视频中，使用 LSRII（BD Bioscience）检测固定或活体的小鼠 32Dkit 白血病细胞（单独存在或作为脾细胞群体的一部分）中的钙蛋白酶活性。结果显示，与正常的脾细胞相比，32Dkit 细胞的钙蛋白酶活性升高。

本文将详细介绍使用流式细胞术在固定细胞和活细胞中检测钙蛋白酶活性的实验方案。

钙蛋白酶是一类普遍存在的细胞内钙离子敏感性中性半胱氨酸蛋白酶¹。钙蛋白酶在多种生理过程中发挥关键作用，……

钙蛋白酶是一类广泛存在的、对细胞内钙离子敏感的中性半胱氨酸蛋白酶，在多种生理过程中发挥关键作用，包括信号转导、细胞骨架重塑、基因表达调控、细胞凋亡以及细胞周期进程。为检测固定细胞和活细胞中的钙蛋白酶活性，可加入荧光底物BUC, LMC MAC。该底物可被钙蛋白酶特异性切割，导致荧光信号增强。通过流式细胞术监测荧光变化，结果显示，与正常细胞相比，30 2D kit细胞中钙蛋白酶活性升高。大家好，我是 Christina Farr，来自多伦多大学免疫学系及大学健康网络 Stewart Berger 博士实验室。今天我将向大家展示如何利用基于流式细胞术的检测方法，在固定和活细胞中测量钙蛋白酶（calpain）活性。我们实验室使用该检测方法来研究白血病和淋巴瘤细胞中的钙蛋白酶活性。那么我们开始吧。在开始实验之前，准备好所需的试剂，包括检测试剂1%多聚甲醛、钙调蛋白抑制剂PD 1500606以及MEK1抑制剂PD 98059。有关这些试剂的配制细节，请参见随附的书面实验方案。向每支离心管中加入一毫升1%多聚甲醛。本视频中每个实验条件需要三支流式管用于固定细胞。共测试三个条件，因此需要九支流式管。使用32 dki细胞开始实验，细胞密度为每毫升0.5至1 × 10⁶个细胞，使用最佳培养基培养。加入胎牛血清、IL-3、肿瘤捕获乙醇及抗生素。将四乘以十的六次方个细胞转移至三个15毫升Falcon管中，每管各一。将管子放入离心机，在15摄氏度下以225 ×g离心5分钟，使细胞成团。离心后弃去上清液，用2毫升室温磷酸盐缓冲液重悬细胞，取一份细胞悬液加入50微摩尔的钙蛋白酶抑制剂PD 150606。用铝箔包裹管子以避光保护样品。短暂涡旋后，在室温避光孵育20至30分钟。用20微摩尔的MEK抑制剂PD 9059处理第二份细胞悬液。将细胞接种至35毫米的组织培养皿中，在37摄氏度下孵育2小时，同时对未处理的样品开始进行钙蛋白酶（Calpain）活性检测。首先，向细胞悬液中加入两毫升检测试剂。立即将一毫升细胞悬液与检测试剂的混合物加入预先准备好的离心管中，以制备时间为零（T=0）的样品。将细胞悬液与检测试剂混合后孵育五分钟。在室温下，将 1 毫升细胞悬液检测试剂混合物加入预先准备好的含 1 毫升 1% 多聚甲醛的离心管中，制备 T 等于 5 的样本。将剩余的细胞悬液继续在室温下与检测试剂混合物共同孵育额外 5 分钟。5 分钟后，将另一毫升细胞悬液转移至已准备好的含 1 毫升 1% 多聚甲醛的离心管中。这是 T 等于 10 分钟的时间点。接下来，在经抑制剂处理的 30 个 2D kit 细胞上重复钙蛋白酶活性检测。用铝箔覆盖支架。于4°C避光条件下固定细胞过夜，次日。在15°C下以725 × g离心5分钟，使细胞沉淀。离心后吸除上清液，然后将细胞重悬于750 µL PBS中。将细胞置于冰上，并在避光条件下保存，直至进行流式细胞术检测。此处展示了固定后细胞的数据采集过程。使用 LSR 二型仪器进行流式细胞术分析。将光波激发或紫外激光激发线设置为355纳米，激光功率设置为25毫瓦，底物和产物的发射波长分别为405纳米和450纳米。用于底物和产物的BAM带通滤光片应分别为405/20和450/50；底物和产物的长通滤光片应分别为405和450。将底物的PMT电压设置为350至375，产物的PMT电压设置为325至350。使用以下参数设置BD fax diva实验：前向散射侧向散射Indo一蓝色，采用对数尺度和一紫色。在工作表中同样使用对数刻度。建立以下图形：前向散射与侧向散射图，并在活细胞上设置门控。使用 Indo-1 蓝色直方图、Indo-1 紫色直方图以及 Indo-1 蓝色对 Indo-1 紫色点图，结合单一线流和含荧光微球的线流，对 LSR II 进行校准。每次实验前，应调整光电倍增管（PMT）电压，使微球荧光直方图的峰值位于相同的通道。在 0 分钟时间点，开始使用 30 2D kit 细胞采集数据。根据需要调整参数电压。每个样本采集并记录 10,000 个事件。用 fax 缓冲液冲洗仪器，并对每个样本重复采集过程。在数据采集完成后导出数据。根据机构指南确保LSR two仪器已清洁。按照之前的方法制备细胞悬液，但不添加检测试剂或钙蛋白酶抑制剂。将样本转移至LSR两型仪器，并按之前方法设置滤光片和参数。按之前方法设置工作表，包括一个显示Indo一蓝随时间变化的大型点图。将程序设置为获取最大数量的事件，不设停止门控。向一份32 G试剂盒细胞悬液中加入50 µM的钙蛋白酶抑制剂。将样品避光，并在细胞孵育的同时于室温下孵育20至30分钟。开始采集不含钙调蛋白抑制剂的30 2D试剂盒细胞悬液的数据。使用200至300个事件/秒的低流速。30 秒到 1 分钟后，将试管从仪器中取出。向细胞中加入 20 µM 的 Bach LMC mac。此为检测试剂。它可被钙蛋白酶特异性切割，其切割会导致底物荧光涡旋增强。随后继续采集数据。采集数据10至20分钟，或直至钙蛋白酶活性达到平台期。接下来，使用经钙蛋白酶抑制剂处理的32 gki细胞重复采集。完成后，导出数据以进行分析。从鼠脾脏制备的细胞悬液开始进行混合细胞实验。将每份细胞悬液均分为两份。其中一份细胞悬液加入50 µM钙蛋白酶抑制剂，用锡箔纸包裹，于室温避光孵育20至30分钟。按照先前所述方法对固定细胞进行钙蛋白酶检测后，用锡箔纸包裹离心管，于4°C避光条件下过夜孵育细胞。第二天，在15摄氏度下以725 G离心五分钟。吸除上清液，用500微升PBS洗涤细胞，再次吸除上清液，将细胞重悬于含2% BSA的200微升染色缓冲液中，室温孵育15分钟。接着，配制一抗，即ZI anti-US。将CD17一抗用染色缓冲液配制，终稀释比例为1:200。确保抗体避光保存。向细胞中加入200 µL一抗，于室温避光孵育30分钟。接下来，加入 400 µL PBS 以增加体积，用于流式细胞术。将细胞置于冰上，并避光保存。使用与固定细胞相同的流式细胞术步骤获取数据。在流式细胞仪数据采集后，将 ZI 添加至参数中，并在工作表中添加 ZI 的直方图。根据前向散射和侧向散射的散点图，使用 FlowJo 软件对活细胞进行分析。从活细胞门中确定 Indo Blue 的平均荧光强度。在此图中，红线表示零分钟时底物的平均荧光强度，蓝线和绿线分别表示五分钟和十分钟时底物的平均荧光 intensity。对于混合细胞群体，使用直方图和点图上的 FXI 荧光来鉴定 30 2D kip 群体。确定 30 2D kip 群体中 endo blue 的平均荧光强度。最后，使用 Microsoft Excel 绘制平均荧光强度的图表。计算 5 到 10 分钟之间直线的斜率。将斜率绘制成柱状图，以确定细胞中钙蛋白酶的活性。此处显示的数据表明，30 种二维细胞具有高水平的钙蛋白酶活性，并且该活性可被 MEK 抑制剂抑制。我们刚刚向您展示了如何在固定细胞和活细胞中检测钙蛋白酶活性。在进行该技术操作时，正确设置 LSR 二型仪器并使用荧光微球校准仪器非常重要。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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