甲基噻唑基四氮唑或MTT法：一种通过测定癌细胞代谢活性来衡量药物耐药性的比色法

甲基噻唑基四唑（MTT）检测法通过测定细胞的代谢活性来评估细胞活力。

开始实验时，配制一系列浓度递增的待测药物。将不同浓度的药物等体积加入多孔板的各孔中。

接下来，将所需的不同药物敏感性的亲本癌细胞及其耐药变体悬浮液分别加入含有不同药物浓度的培养基中，每种细胞悬液加入一组孔板中。孵育该孔板。

在培养过程中，药物敏感型癌细胞对药物分子敏感，即使在低浓度下也会导致细胞死亡。相反，耐药型癌细胞对药物分子不敏感，即使在较高药物浓度下仍能存活并增殖。

用 MTT 溶液处理细胞并进行孵育。MTT 是一种带正电荷的四唑盐，可轻易穿透代谢活跃的细胞。在这些细胞内，依赖 NAD(P)H 的氧化还原酶将 MTT 盐还原为不溶于水的甲臜结晶，后者被转运至细胞表面。 

现在，向孔中加入适量的溶解液。充分混匀，使甲臜晶体溶解成有色溶液。最后，使用酶标仪测定有色溶液的吸光度，以反映细胞代谢活性。

含有耐药性癌细胞的孔中颜色强度更高，表明与药物敏感性癌细胞相比，细胞活力增加。

准备一块96孔平底实验板。留出若干孔用于药物浓度梯度、细胞对照以及不含细胞的培养基对照。配制地塞米松（dexamethasone）或Dex的药物稀释系列。将每种Dex稀释液各30微升加入96孔板中相应的孔内。确保每种浓度均设三个复孔。

收集处于指数生长期的白血病细胞，并将其重悬于最佳接种浓度。将120微升细胞悬液加入每个含有药物溶液或生长培养基的孔中，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育72小时。孵育结束后，使用多通道移液器向每孔加入15微升MTT试剂。

使用平板振荡器以最高每分钟900次的频率振荡培养板5分钟。将培养板放回37摄氏度、含5%二氧化碳的细胞培养孵箱中，继续孵育4至6小时。

孵育后，务必充分重悬甲臜结晶，因为吸光度值依赖于该化合物的充分溶解。

向每个孔中加入 150 µL 酸化异丙醇，并用多通道移液器充分混匀，以彻底重悬所有甲臜晶体。使用酶标仪测定 540 nm 和 720 nm 处的光密度（OD），通过校正背景 OD 以确保测量结果准确。