鳉胚胎和细胞移植嵌合体生成Dechorionation

由于硬的蛋壳和软的胚胎，操纵鳉胚胎是比在斑马鱼中更多地参与。该视频显示一步一步的程序，包括dechorionation如何操作鳉胚胎，在琼脂糖凝胶成像和细胞移植嵌合体的生产安装。这些程序是必不可少的，在实验室中使用鳉和斑马鱼为脊椎动物的基因组功能基因清扫充分利用其互补性的特点。

该程序的总体目标是在胚胎中产生克隆，以检查感兴趣的基因或蛋白质的自主性。这是通过在单细胞阶段通过显微注射用 Rod Domine 葡聚糖标记供体胚胎来实现的，如本视频的配套内容所示，Maka 胚胎的显微注射。该程序的第二步是将供体和受体胚胎发育到正确的阶段。

该程序的第三步是对供体和受体的胚胎进行涂层。该程序的最后一步是将细胞从标记的供体胚胎移植到受体的胚胎中。最终，可以通过荧光或谱系示踪剂检测移植细胞来分析移植细胞克隆的分布、增殖和分化，从而获得结果。

嗨，我是来自巴斯大学生物与生物化学系 Makoto Fki 博士实验室的 Sean Brazinski。我也是 Zeki 实验室的 wan。今天我们将向您展示一种在深色鱼胚胎中进行细胞移植的程序。

我们在实验室中使用该程序来研究感兴趣的基因或突变，具有细胞或非细胞自主功能。那么让我们开始吧。在对黑茄蛋进行涂层时，使用无菌溶液和工具来提高长期观察和培养的成功率。

将一张 P 2000 粒度防水砂纸放入 9 厘米非粘附培养皿的盖子中。使用广口火焰抛光意大利面移液器从一盘鸡蛋中转移多达 10 个新鲜、未聚集、清洁和贴有标签的鸡蛋。中等到砂纸。

去除多余的培养基，在盘子里留下足够的食物，以防止鸡蛋变干。用戴手套的指尖在砂纸上轻轻滚动 10 个鸡蛋，一次 45 到 60 秒。要去除外表面的毛发并在可丽耐表面划线，请施加最小压力并保持指尖与砂纸平行。

将鸡蛋转移到原盘中。去除培养基，用每毫升 20 毫克的尿液覆盖鸡蛋。盖上培养皿，在 27 摄氏度下孵育 60 分钟。

确保将培养皿倾斜放置，以便胚胎充分浸入酶中。为了最大限度地减少所需的酶，使用塑料移液管回收链霉蛋白酶以供重复使用，并将其置于冰上。在胚胎培养基中清洗鸡蛋五次，以去除所有易发的痕迹，以防止其消化孵化酶。

加入足够的孵化酶以覆盖洗净的鸡蛋。确保鸡蛋在盘子底部保持单层，以避免在可丽耐溶解时被压碎。在 27 摄氏度下孵化鸡蛋。

确保将培养皿倾斜放置，以便胚胎充分浸入酶中。为了最大限度地减少在解剖立体显微镜下检查所需的酶，在可丽耐完全溶解之前，可丽耐的内层会出现类似的孔洞。该过程可能需要长达 60 分钟，具体取决于酶活性。

当可丽耐的一小部分溶解时，立即用移液管吸取单个鸡蛋，以避免胚胎被孵化酶消化。将移液管的尖端轻轻接触 1 倍 BSS 的干净培养皿，让鸡蛋滚出，以尽量减少转移孵化酶，转移到 1 倍 BSS 的干净培养皿中。当所有鸡蛋都从孵化酶中转移出来时，用镊子去除可丽耐的其余部分。

最后一次转移到一 次 BBSS 的新菜。如果要将胚胎带到胚胎发育的后期阶段，请添加抗生素 该程序装饰后，在移植前 1.5 小时开始对第 12 阶段的胚胎进行 dec 涂层。使用移液器吸头将少量 3% 甲基纤维素添加到腔体显微镜的中心。

滑入 9 厘米的培养皿中。将液体薄薄地涂抹在凹陷的表面上。将甲基纤维素干燥 2 分钟。

在解剖显微镜下用 350 微升无菌一次性 BSS 填充载玻片凹陷。使用宽口火焰抛光玻璃移液器将一个供体和最多四个受体胚胎转移到载玻片上。使用发环调整胚胎的方向，使 blaster derm 朝上。

如有必要，将胚胎彼此靠在一起以保持稳定性。轻轻地将微针插入供体 blaster。皮肤。缓慢吸收 10 到 20 个细胞。

现在轻轻地将针头插入受体胚胎冲击波皮肤的相关区域，慢慢排出供体细胞。不要打扰大提琴囊的边界。小心地用大约 30 毫升无菌一次性 BSS 填充培养皿，以浸入胚胎并从甲基纤维素中松开胚胎。

倒在培养皿的侧面，以免破坏胚胎。将 100 微升青霉素链霉素加入培养皿中，浓度约为 0.3%盖上培养皿。必要时定期观察胚胎。

对于较长的成像研究，例如延时和详细观察，将活体涂层胚胎嵌入麻醉活胚胎中，方法是在含有胚胎的培养基中加入适当的阶段麻醉剂，熔化大约一毫升 3%低熔点在 BSS 中出现，并保持在 37 摄氏度。如果需要，向 aros 中添加适量的麻醉剂以防止抽搐快速防止凝固，使用广口意大利面移液器填充盖子。带有 aros 的微型离心管凹陷。

使用广口移液器将一个涂被和麻醉的胚胎移动到盖子中的 aros 中。尽可能少地转移胚胎培养基。立即更新 aros 和胚胎并将它们移动到 3.5 厘米的玻璃底培养皿中。

将培养皿转移到一个 14 厘米长的培养皿中，培养皿中装满了三分之一的冰和水混合物。在解剖立体显微镜下将较小的培养皿牢牢地压在较大的培养皿的底部。根据需要使用发环快速定位胚胎。

保持胚胎静止不动，直到 agro 凝固。现在可以对胚胎进行成像。图 A 显示了移植后立即的供体和受体胚胎。

供体胚胎如右侧所示，带有完全红色标记的石膏真皮。受体胚胎显示在左侧，很容易通过冲击波皮肤图像 B 中可见的一小块红色移植细胞来识别，图像 B 显示了移植后大约 7 小时的两个受体胚胎。请注意，移植的细胞已从移植部位迁移，现在分散在冲击波中。

皮肤图像 C 显示了受体的胚胎在第 29 阶段。注意眼睛中的色素沉着以及躯干和大脑区域存在 mefor。可以看到杆状 domine 标记的细胞定植于许多胚胎结构中，表明嵌合体的成功产生。

我们刚刚向您展示了如何食用麦加鱼胚胎并在胚胎早期阶段进行细胞移植。进行此程序时，请务必记住将供体细胞移植到受体爆破 inm 的正确区域。这将使您的供体细胞分化成正确的细胞类型。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。