Name: 鳉胚胎和细胞移植嵌合体生成Dechorionation (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学习青鳉胚胎去壳和细胞移植技术，用于发育生物学研究。该方法通过荧光标记供体细胞并移植到受体胚胎，帮助研究人员分析基因或蛋白的细胞自主性功能，为脊椎动物遗传学研究提供重要工具。

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本工作由 M. F-S. 获得的英国医学研究委员会（MRC）资助支持。

1. 胚胎的发育
<ol>
 <li>卵子产出时由于卵壳上的附着丝而聚集成团。为了使胚胎正常发育，需要将卵子分离。用两把镊子夹住附着丝，将其缠绕并剪断，以实现分离。</li>
 <li>分散后，将卵子与粪便和藻类分离，并转移至新鲜的胚胎培养液中，每6 cm培养皿中最多放置40枚卵。</li>
 <li>在27°C条件下，青鳉胚胎的发育速度略慢于斑马鱼。两种物种的孵化时间不同：青鳉胚胎在7天后从卵壳中孵出，并立即开始游动和摄食；而斑马鱼胚胎在2天后孵出，但需5–6天才开始游动和摄食。青鳉的发育分期依据岩松分期标准4。</li>
 <li>通过选择适宜的温度，可方便地调节青鳉胚胎的发育进程以适应实验安排。在早期发育阶段，可将胚胎置于4°C环境中使其发育暂停。在第24期之后（心脏开始跳动后），可将最低温度设为18°C以减缓发育速度。</li>
 <li>与斑马鱼相比，青鳉器官/组织出现的时间略有差异；例如，在青鳉中，体节形成发生在脑发育启动之后，而在斑马鱼中，体节形成早于脑发育。</li>
</ol>
2. 去除绒毛膜
青鳉的卵膜由两层保护结构组成，内层较硬，外层较软。因此，需要采用蛋白酶分两步处理，即先用蛋白酶K（pronase），再用孵化酶，以去除该卵膜。
去壳后，胚胎应保存在1X BSS中。半无菌条件有助于提高去壳胚胎培养的成功率，尤其是在需要较长时间观察时。这些条件包括使用无菌溶液（例如，添加抗生素的灭菌1X BSS）以及用70%乙醇灭菌后以1X BSS冲洗的无菌工具。
由于去壳的青鳉胚胎比去壳的斑马鱼胚胎更柔软且更脆弱，因此必须格外小心，确保胚胎不接触空气或移液管中的气泡，否则会导致胚胎立即塌陷。为尽量减少对胚胎的损伤，转移胚胎时应使用宽口经热抛光的玻璃移液管配合移液器泵，观察时可用毛细环调整胚胎方向。应使用防吸附的培养皿，以防止胚胎附着于器皿表面。
<ol>
 <li>去壳前应检查卵是否已充分分离和清洁。</li>
 <li>由于蛋白酶和孵化酶均为蛋白酶类，应将其置于冰上保存，并尽量减少胚胎暴露于这些酶的时间。</li>
 <li>将卵转移至置于9 cm培养皿盖内的砂纸（P2000粒度，防水）上。去除多余培养基，但需保留足够体积以防止胚胎干燥。</li>
 <li>轻轻滚动胚胎约45–60秒，以去除部分外层绒毛并轻微划伤卵壳表面（图1）。将胚胎转移回原培养皿中进行观察。 
 
 在砂纸上滚动胚胎时，使用食指，施加最小压力，并保持手指与砂纸表面平行。每次滚动不超过5–7个胚胎。此预防措施可最大限度降低胚胎相互挤压而破裂的风险。 
 
 </li>
 <li>用20 mg/ml蛋白酶替换培养皿中的卵培养基，并在27°C下孵育胚胎40–60分钟。 
 
 确保胚胎被蛋白酶充分覆盖，且培养皿加盖。此步骤期间未使用的蛋白酶应置于冰上，以减少自降解，可重复使用直至活性丧失（约1–2周）。 
 
 </li>
 <li>回收蛋白酶以供再用，并用胚胎培养基洗涤胚胎5次，以去除残留的蛋白酶，否则会影响后续添加的孵化酶活性。</li>
 <li>去除胚胎培养基，加入孵化酶覆盖胚胎，确保胚胎在培养皿中呈单层分布。 
 
 若卵在培养皿中堆叠，底层的胚胎将在卵壳溶解过程中被压碎。未使用的孵化酶应保持在冰上。 
 
 </li>
 <li>在27°C下孵育胚胎，15分钟后开始定期使用体视显微镜检查孵化进展。 
 
 可观察到卵壳内层开始出现多个类似月球陨石坑的小孔，随后内层迅速溶解，仅剩柔软的外层，可手动轻易去除。整个孵化过程可能需要15–60分钟。 
 
 </li>
 <li>一旦胚胎从卵壳中脱出，立即将其转移至含有1X BSS的培养皿中。 
 
 转移时避免将孵化酶带入1X BSS中，可将移液器尖端轻触BSS液面，使胚胎缓慢滚出。 
 
 </li>
 <li>当所有胚胎均从孵化酶中转移后，再进行一次最终转移至另一新鲜的1X BSS培养皿中。 
 
 此步骤可确保胚胎不再接触任何残留的孵化酶，以免损伤暴露的胚胎。在最终培养皿中，仍保留卵壳外层的胚胎可在体视显微镜下使用灭菌的显微镊子手动分离。 
 
 若去壳后需继续培养胚胎，应在BSS中添加青霉素/链霉素以防止细菌生长。 
 
 </li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="斑马鱼胚胎发育，显微图像 A&amp;B 显示细胞结构和生长阶段。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 脱膜过程中卷曲与未卷曲胚胎的比较。注意观察 B 面板中卷曲的胚胎缺少 A 面板未卷曲胚胎所具有的毛状结构。
3. 固定去壳胚胎
琼脂糖包埋适用于活体胚胎的长时间成像（例如延时成像），也适用于固定胚胎的详细观察。在原肠胚形成期及早期器官发生期（第14至第28期），青鳉胚胎的表层组织（覆盖发育中胚胎和卵黄的一层组织）会表现出节律性的收缩运动波5。通过使用3.5 mM 1-庚醇处理胚胎，可抑制其收缩运动6。
为防止28期（64小时）后胚胎移动，可在包埋前滴加甲基氨基苯甲酸乙酯（TMS）对胚胎进行麻醉。同时将TMS加入琼脂糖中（仅需加入极少量，该浓度需优化，约为1:25稀释）。
<ol>
 <li>将少量3%低凝胶温度琼脂糖（溶于1× BSS中）加热至37°C使其解冻，并在此温度下保持。</li>
 <li>以下步骤需迅速操作，以确保在胚胎定位完成前琼脂糖不会凝固。使用宽口玻璃移液管转移足量熔融琼脂糖至Eppendorf管盖的凹槽内。</li>
 <li>将一个去壳胚胎转移至管盖凹槽中，尽量减少随胚胎带入的BSS液体。立即从凹槽中吸取琼脂糖和胚胎，并转移至培养皿成像室。 
 
 使用底部带有玻璃窗口的3.5 cm培养皿。若使用倒置显微镜成像，应将胚胎腹面朝下定位，并紧贴盖玻片放置；若使用正置显微镜成像，则应尽量减少琼脂糖的厚度。 </li>
 <li>将3.5 cm培养皿放入盛有冰水混合物的大培养皿中（14 cm直径，加水至约其总深度的1/3）。在将成像室牢牢压在14 cm培养皿底部的同时，用毛细环在熔融琼脂糖中轻柔地调整胚胎至所需方向，并通过轻微上下移动小培养皿至其在冰水中的原始位置，保持胚胎位置直至琼脂糖凝固。</li>
</ol>
4. 青鳉胚胎中的细胞移植
本实验的目的是确定目标基因是细胞自主性发挥作用（在细胞内）还是非细胞自主性发挥作用（细胞之间）。
移植前可使用示踪染料（如罗丹明-葡聚糖）对供体细胞进行标记（具体步骤见配套的 JoVE 方案《青鳉胚胎显微注射》），或采用表达 GFP 的转基因品系，以便于移植后的评估。结合使用这两种标记技术通常有助于克服可能出现的自发荧光问题。对于移植后的时间序列研究，GFP 表达尤为有用。
在整个操作过程中使用带移液球的宽口玻璃移液管，并在操作前用70%乙醇对所有工具（包括载玻片）进行消毒，随后用无菌1×BSS彻底冲洗。受体胚胎通常发育至约12期，此时便于在进行移植操作时区分腹侧和背侧极性。
<ol>
 <li>在移植前1.5小时开始去除胚胎的卵膜，并在酶孵育期间准备显微注射装置。</li>
 <li>将一个凹面载玻片放入直径为9 cm的培养皿中。</li>
 <li>使用无菌移液枪头吸取少量3%甲基纤维素，滴加至凹面载玻片中央，并均匀薄层涂布。</li>
 <li>将甲基纤维素干燥约1-2分钟。</li>
 <li>加入350μl无菌1X BSS，使凹面完全浸没。</li>
 <li>使用玻璃移液管将一个供体胚胎和最多四个受体胚胎转移至载玻片上。</li>
 <li>使用毛发环调整胚胎方向，使胚胎的胚盘朝上。 
 
 可将胚胎相互倚靠以进一步提高稳定性。 
 
 </li>
 <li>将显微注射针轻轻插入供体胚胎的胚盘，缓慢吸取10-20个细胞。</li>
 <li>将注射针轻轻插入受体胚胎胚盘的相应区域，缓慢释放细胞。插入细胞时需格外小心，避免破坏细胞与卵黄囊之间的边界，否则将导致胚胎死亡。</li>
 <li>将无菌1X BSS倒入培养皿中。 
 
 倒入BSS时应尽量靠近培养皿侧壁，避免扰动胚胎。切勿将BSS直接倾倒在胚胎上，并加入足量BSS以完全浸没载玻片和胚胎。 
 
 </li>
 <li>向培养皿中加入100μl青霉素/链霉素，盖上皿盖。小心将培养皿转移至27°C培养箱中，以促进胚胎正常发育。</li>
 <li>可根据需要定期观察胚胎。当利用移植技术进行功能获得和/或表型挽救实验时，所观察到的某些形态学变化可能源于移植操作本身的影响，因此需进行多次移植实验。移植后2-3天，卵黄囊、头部、眼睛和躯干上应出现黑色素细胞。若在移植胚胎中观察到上述现象，则很可能已成功构建嵌合体（图3）。</li>
</ol>
如有必要，通过将供体胚胎转移至含有25μl 20mg/ml蛋白酶K的PCR管中进行基因型鉴定。55°C孵育4小时，随后94°C孵育10分钟，然后进行PCR反应。
5. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="胚胎细胞生长；明场与GFP显微镜观察；细胞结构分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 琼脂糖包埋胚胎的示例位置。右侧为胚胎前端，视角为背侧。B 面板：可见位于胚胎体两侧的内皮细胞，该细胞由 fli 启动子驱动的 GFP 标记。
<img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="细胞分裂阶段；显微镜图像；阶段11、15、29；红色标记指示分裂位点。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3. 移植后胚胎的图像。图像A显示了移植后立即拍摄的供体与受体胚胎。右侧为供体胚胎，其囊胚层完全呈红色（箭头所示）；左侧为受体胚胎，其囊胚层中可见一小团红色移植细胞（箭头所示），易于识别。图像B显示了移植后约7小时（在27°C下培养）的两个受体胚胎。注意移植的细胞已从移植位点迁移，并现分散于整个囊胚层（箭头所示）。图像C显示了阶段29（约74小时）的受体胚胎。可见眼部的色素沉着，以及躯干和脑区的黑素细胞（箭头所示）。罗丹明标记的细胞可见定植于多个胚胎结构中，表明嵌合体已成功生成。

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在本视频中，我们将演示如何对青鳉胚胎进行去壳处理并实施细胞移植。该技术是一种强大的方法，可用于生成嵌合胚胎，以研究基因/蛋白质在发育过程中的功能，并阐明目标基因/蛋白质作用的自主性。青鳉作为一种有用的脊椎动物模型系统，具有明确的命运图谱，且胚胎透明，非常适合应用于该技术。 体内 实时成像。移植可与显微注射技术结合使用（详见配套的 JoVE 实验方案《Medaka 胚胎的显微注射》），以便于观察移植细胞的行为。

<table><tbody><tr><td>胚胎培养基</td><td>试剂</td><td>本实验室制备</td><td>N/A</td><td>200ml 50倍浓缩液，1ml 1%亚甲蓝溶于H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10升反渗透水（50倍浓缩液配方：NaCl 14.7g，KCl 0.6g，CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2.4g，MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4.0g/1升反渗透水）</td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>工具</td><td>55 INOX A.DUMONT&amp;FILS</td><td>N/A</td><td>尖端非常锋利，用于去除卵膜。</td></tr><tr><td>细粒度防水砂纸 - p2000粒径</td><td>工具</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td>N/A</td><td>极细粒径，用于滚动或清洁带卵膜的胚胎。</td></tr><tr><td>3%甲基纤维素</td><td>试剂</td><td>Sigma</td><td>M 0512</td><td>高黏度，用于在移植过程中固定胚胎位置。</td></tr><tr><td>1X BSS</td><td>试剂</td><td>本实验室制备</td><td>N/A</td><td>20X BSS：130g NaCl，8g KCl，4g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，4g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，10mg酚红溶于1L MilliQ水，高压灭菌；500mM Hepes溶于MilliQ水，高压灭菌。使用前加入25ml 20X BSS和15ml 500mM Hepes（pH 7.0），加水至500ml，过滤除菌。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>试剂</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>在孵育去卵膜胚胎时加入BSS中。</td></tr><tr><td>蛋白酶Pronase</td><td>试剂</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>用于去除卵膜。</td></tr><tr><td>孵化酶</td><td>试剂</td><td>本实验室制备</td><td>N/A</td><td>用于去除卵膜。</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（TMS）</td><td>试剂</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>400mg三卡因溶于97.9ml蒸馏水和2.1ml 1M Tris中，pH调至7；使用时取4.2ml该溶液加入100ml洁净鱼缸水中。</td></tr><tr><td>3%超低凝胶温度琼脂糖</td><td>试剂</td><td>Sigma</td><td>A-2576</td><td>IX-A型。用于胚胎包埋以进行观察。</td></tr><tr><td>培养皿观察室</td><td>工具</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>11-004-008</td><td>Iwaki玻璃底培养皿，直径35mm，带12mm观察窗。用于胚胎包埋观察。</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>设备</td><td>Narishige</td><td>N/A</td><td>型号MN151。用于移植过程中细胞的取出与植入。</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>工具</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10T</td><td>用于制作移植针。</td></tr><tr><td>火焰/布朗微电极拉制仪</td><td>设备</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>用于制作移植针。</td></tr></tbody></table>

青鳉胚胎去壳及用于嵌合体制备的细胞移植

关键词：青鳉，胚胎去壳，细胞移植，嵌合体，发育生物学，模式生物

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

青鳉是一种小型卵生淡水鱼类，可同时进行遗传学和胚胎学分析，是三种开展过全基因组表型驱动突变体筛选的脊椎动物模式生物之一1。青鳉与斑马鱼在相关基因功能重叠方面的差异使得能够鉴定出在单一物种中无法识别的新表型2，因此青鳉与斑马鱼在解析脊椎动物基因组功能方面具有互补性。在实验室中对青鳉胚胎进行操作，例如去壳、为成像而固定胚胎以及细胞移植，是同时研究青鳉和斑马鱼的关键步骤。细胞移植可用于检验青鳉突变的细胞自主性。通过将标记的供体胚胎细胞移植到未标记的受体胚胎中，可产生嵌合体。根据命运图谱3，可将供体细胞移植至受体胚胎的特定区域，从而使移植细胞的克隆在发育过程中整合到目标组织中。由于青鳉胚胎具有坚硬的卵膜和柔软的胚胎本体，其操作难度较斑马鱼更高。在本视频中，我们将展示操作青鳉胚胎的详细步骤。

由于青鳉胚胎具有坚硬的卵壳和柔软的胚胎组织，其操作比斑马鱼更为复杂。本视频逐步展示了青鳉胚胎操作的各项技术，包括脱膜处理、琼脂糖包埋用于成像以及细胞移植以制备嵌合体。这些技术对于在实验室中充分利用青鳉与斑马鱼在脊椎动物基因组功能遗传解析方面的互补优势至关重要。

青鳉是一种小型卵生淡水鱼，可进行遗传学和胚胎学分析，是三种脊椎动物模式生物之一……

本实验的总体目标是通过在胚胎中产生克隆，以研究目的基因或蛋白质的功能自主性。该目标通过在单细胞阶段对供体胚胎进行显微注射，利用罗丹明标记的葡聚糖（Rod Domine dextran）对其进行标记来实现，具体操作如本视频的配套视频“Maka胚胎的显微注射”中所示。实验的第二步是将供体和受体胚胎共同培养至合适的发育阶段。该实验步骤的第三步是对供体和受体胚胎均进行包被处理。该实验步骤的最后一步是将标记的供体胚胎中的细胞移植到受体胚胎中。最终，可通过检测移植细胞的荧光信号或谱系示踪剂，分析移植细胞克隆的分布、增殖与分化情况，从而获得实验结果。大家好，我是来自巴斯大学生物与生物化学系藤井真实验室的 Sean Brazinski。我同时也来自泽基实验室。今天我们将向您展示一种在斑马鱼胚胎中进行细胞移植的实验方法。我们在实验室中使用此方法来研究某个感兴趣的基因或突变是否具有细胞自主性或非细胞自主性功能。现在我们开始操作。在包被斑马鱼卵时，应使用无菌溶液和工具，以提高长期观察和培养的成功率。将一片P 2000目防水砂纸放入直径9厘米的非黏附性培养皿盖中。使用宽口火焰抛光的巴斯德移液管，从盛有卵液的培养皿中转移最多10个新近解聚、清洗并标记好的卵至砂纸上。吸除多余培养基，仅保留足以防止卵干燥的少量液体。戴上手套后，用指尖轻轻将10枚卵分批在砂纸上滚动45至60秒。为去除卵外表面的绒毛并划伤康林表面，操作时应施加最小压力，并保持指尖与砂纸平行。将卵转移至原有的培养基培养皿中。移除培养基，用含有20毫克/毫升蛋白酶的溶液覆盖卵。盖上培养皿，在27°C条件下孵育60分钟。确保将培养皿倾斜放置，使胚胎充分浸入酶液中。为尽量减少酶的使用量，可用塑料移液管回收蛋白酶以重复使用，并将其置于冰上。用胚胎培养基洗涤卵子五次，以彻底清除残留的蛋白酶，防止其消化孵化酶。加入足量的孵化酶以覆盖已清洗的卵。确保卵在培养皿底部保持单层排列，以避免随着卵膜溶解而压碎卵。将卵在27°C条件下孵育。确保将培养皿倾斜放置，使胚胎充分浸入酶液中。为尽量减少酶的使用量，需在解剖体视显微镜下检查消化进展，当绒毛膜内层出现类似的小孔、但尚未完全溶解时，即为适宜时机。该过程可能需要长达60分钟，具体时间取决于酶的活性。当Corian的少量部分溶解后，立即用移液器吸出单个卵子，以避免孵化酶对胚胎的消化。通过轻轻将移液器尖端接触盛有一倍BSS的洁净培养皿，使卵子自然滚出，将其转移至该培养皿中，以尽量减少孵化酶的带入。当所有卵子均从孵化酶中转移完毕后，使用镊子去除剩余的Corian。 最终转移至含有1倍BBSS的新培养皿中。如果需要将胚胎培养至更晚的发育阶段，则在此步骤处理后加入抗生素。为进行移植，需在移植前1.5小时开始对12期胚胎进行脱胶处理。使用移液器吸头向凹面载玻片中心加入少量3%甲基纤维素。将一个九厘米的培养皿滑入。将液体均匀铺展在凹面表面。干燥甲基纤维素两分钟。在解剖显微镜下，向载玻片凹槽中加入 350 µL 无菌的 1× BSS。使用口径较宽且经火焰抛光的玻璃移液管，将一个供体胚胎和最多四个受体胚胎转移至载玻片上。利用毛细环调整胚胎方向，使表皮胚层朝上。必要时可将胚胎相互倚靠以保持稳定。将微针轻轻插入供体外胚层，缓慢吸取10至20个细胞。现在将针头轻轻插入受体胚胎的囊胚层相应区域，缓慢注入供体细胞。注意不要扰动卵黄囊边界。小心地向培养皿中加入约 30 毫升无菌的 1 倍 BSS，以浸没胚胎并使胚胎从甲基纤维素中松脱。沿培养皿侧壁加入，以免扰动胚胎。向培养皿中加入100微升青霉素-链霉素溶液，使其终浓度约为0.3%。盖上培养皿。根据需要定期观察胚胎发育情况。对于较长时间的成像研究，例如延时成像和详细观察，可将活体包埋的胚胎置于低熔点琼脂糖中，并通过向含有胚胎的培养基中添加适当阶段的麻醉剂来麻醉活体胚胎，以防止其移动。取约一毫升3%的低熔点琼脂糖，溶于一倍浓度的BSS中，并保持在37摄氏度。如有需要，向琼脂糖中加入适量麻醉剂以防止胚胎抽搐。操作需迅速，以防琼脂糖凝固，使用宽口巴斯德吸管将琼脂糖填充至微型离心管的凹槽盖中。使用宽口移液管将一个包被且已麻醉的胚胎转移至盖片上的 aros 中。转移时尽量减少随胚胎带入的培养基。立即更新 aros 和胚胎，并将其移入直径为 3.5 厘米的玻璃底培养皿中。将培养皿转移至一个14厘米的培养皿中，该培养皿内装有占其体积三分之一的冰水混合物。在解剖体视显微镜下，将较小的培养皿牢固地压在较大培养皿的底部。使用毛细环迅速将胚胎调整至所需方向。保持胚胎静止，直至农杆菌溶液凝固。此时可对胚胎进行成像。图A显示了移植后立即拍摄的供体与受体胚胎。右侧显示的是供体胚胎，其体表外胚层完全被红色标记。左侧为受体胚胎，可通过囊胚外胚层图像中可见的一小团红色移植细胞轻松识别。图B显示了移植后约七小时的两个受体胚胎。注意，移植的细胞已从移植部位迁移，并现分散分布于整个囊胚中。皮肤图像 C 显示受体胚胎在 29 期的发育情况。注意眼部的色素沉着以及躯干和脑区中 mefor 的存在。可见标记的杆状结构域细胞已定植于许多胚胎结构中，表明嵌合体已成功生成。我们刚刚向您展示了如何对斑马鱼胚胎进行处理，并在早期胚胎阶段进行细胞移植。进行此操作时，重要的是要记住将供体细胞移植到受体囊胚的正确区域，这将使供体细胞能够分化为正确的细胞类型。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

鳉胚胎和细胞移植嵌合体生成Dechorionation

通过囊胚期或原肠胚期移植，生成特定嵌合斑马鱼胚胎的逐步操作指南。...

通过移植生成嵌合体斑马鱼胚胎

斑马鱼细胞移植技术能够结合遗传学与胚胎学方法，生成组织特异性的嵌合体。本视频展示了囊胚期阶段的细胞移植操作，该技术使我们的实验室得以研究前脑联合纤维形成过程中星形胶质细胞群体及特定导向信号分子的作用。...

组织靶向胚胎嵌合体：斑马鱼原肠胚细胞移植

我们演示了一种用于生成嵌合体斑马鱼胚胎的实验方案，以在胚胎发育过程中对细胞行为进行活体成像观察。...

移植表达GFP的卵裂球用于嵌合斑马鱼胚胎视网膜和脑发育的活体成像

青鳉和斑马鱼在脊椎动物基因组功能的遗传解析方面具有互补性。本方案重点介绍了对青鳉胚胎进行显微注射的关键步骤，这是实验室中利用青鳉和斑马鱼开展胚胎学与遗传学分析的重要技术。...

作为模式遗传生物的青鳉胚胎显微注射

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通过跨物种移植分析神经嵴细胞的迁移与分化

小型实验鱼类已成为研究人类骨骼疾病机制及筛选骨调节药物的流行模型。本报告中，我们描述了一种评估阿仑膦酸钠对骨质疏松病变青鳉幼鱼骨细胞作用的实验方案。...

药物处理与 在体 内 青鳉鱼骨质疏松模型中成骨细胞与破骨细胞相互作用的成像研究

在不同遗传背景下对单个野生型视网膜前体细胞进行活体追踪，可评估细胞非自主性信号在神经发生过程中的作用。本文结合基因敲低、通过胚胎移植构建嵌合体以及 体内...

体内成像嵌合体斑马鱼胚胎中单个视网膜前体细胞的转基因表达以研究细胞非自主性影响

本文介绍一种无需使用新设备即可提高嵌合体生产效率的实验方案。通过简单改变胚胎注射时的方位，可增加所获得胚胎的数量，并可能缩短种系传递的时间进程。...

内细胞团内注射胚胎干细胞可提高嵌合率

本实验方案的目标是利用胚胎组织移植技术，产生具有源自Cas9诱变供体组织的单倍体前肢的嵌合体墨西哥钝口螈。...

通过胚胎移植生成具有突变单倍体肢体的嵌合体墨西哥钝口螈

胚胎学操作（如细胞切除和移植）是研究早期发育的重要工具。本方案描述了一种简单且有效的移植装置，可用于斑马鱼胚胎的此类操作。...

一种用于斑马鱼胚胎移植的简单高效装置

学习青鳉胚胎去壳和细胞移植技术，用于发育生物学研究。该方法通过荧光标记供体细胞并移植到受体胚胎，帮助研究人员分析基因或蛋白的细胞自主性功能，为脊椎动物遗传学研究提供重要工具。

青鳉胚胎去壳及用于嵌合体制备的细胞移植关键词：青鳉，胚胎去壳，细胞移植，嵌合体，发育生物学，模式生物

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