质粒DNA重组流感病毒的一代

以下实验的总体目标是从质粒 DNA 生成重组流感病毒。这是通过使用 Lipectomy 2000 作为第二步，将编码 DNA 质粒的 8 个流感基因横切到 2、9、3 t 和 MDCK 细胞的共培养物中来实现的。组织培养的旋腹将用于感染新鲜的 MDCK 细胞和/或 10 天大的鸡胚蛋，这将从转染细胞中扩增潜旋物中存在的病毒。

接下来，我们将从受感染的鸡胚蛋中收获组织培养物上清液和 Alan Toic 液。为了通过使用 HA 测定来确认病毒的存在，根据凝集的存在获得显示病毒存在的结果。大家好，我是罗切斯特大学微生物学和免疫学系的 Luis Martinez Rito。

今天，我将向您展示如何从质粒 DNA 中拯救重组流感病毒。我们在实验室中使用这项技术来研究流感病毒生物学的多个方面，并开发潜在的载体和疫苗。那么让我们开始吧。

在开始转染温热细胞培养试剂至 37 摄氏度之前，使用含 10% 胎牛血清 FBS 和 1% 青霉素链霉素 PS 的 1 倍磷酸盐缓冲盐水、P-B-S-E-D-T-A、胰蛋白酶和 KO 改良的 eagles 培养基 DMEM。接下来，每次转染制备 250 μL opti MEM 培养基和 6 至 8 μL LPF 2000，并在室温下孵育 5 至 10 分钟。将 1 μg 质粒 DNA 加入装有 50 μL opti MEM 培养基的试管中，制备质粒转染混合物。在含有病毒片段的 8 个 PDZ 质粒中，每个添加 1 微克。

PB 两个 PB 一个 pa ha np na m 和 N MS。将 250 μL 室温 opti MEML PF 2000 加入流感 DNA 质粒转染混合物中，并在室温下孵育 20 至 30 分钟。同时，制备 2 9 3 T 和 MDCK 细胞的悬浮液用于转染。2、9、3 T 和 MDCK 细胞的密度应为 80% 至 90% 汇合。

转染当天，大约用 5 乘以 10 到每 100 毫米培养皿中 6 个细胞洗涤细胞分离并使用标准细胞培养技术离心。将 2 9 3 个 T 细胞重悬于 3 毫升 D-M-E-M-F-B-S-P-S 中。当 Resus 悬浮时，将 3 毫升输送到 MDCK 细胞进行重悬。

这将产生 2、9、3 T 和 MDCK 细胞的混合物，用作共培养物。每孔加入 250 毫升 2 9 3 T-M-D-C-K 细胞中，放入六孔板中。20 至 30 分钟后，向每个 opti M-E-M-L-P-F 2000 流感 DNA 质粒混合物中加入 1 毫升 DMEM 10%FBS 1%PS。

然后加入 250 毫升 2 9 3 T-M-D-C-K 细胞的孔中。轻轻摇动六孔板，让转染物在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中孵育过夜。第二天，即转染后 16 至 24 小时，更换转染培养基，并将转染细胞在含有 1 μg/mL 甲苯乙基氯酮或 TPCK 处理的胰蛋白酶的 DMEM 0.3% 牛白蛋白或 BA 1%PS 中孵育 48 小时。

如果需要 MDCK 感染，请在感染前 1 天或初始病毒转染后 2 天对新鲜 MDCK 细胞进行铺板，然后在更换培养基后 48 小时将 SUP natant 从转染细胞转移到微量离心管离心机中。在感染 MDCK 细胞之前，组织培养物在微量离心机中以 13， 000 RPM 的转速供应纳脱剂 1 至 2 分钟。在显微镜下检查细胞以确认单层，然后进行感染 用一毫升一倍 PBS 洗涤细胞两次。

加入 200 μL 来自先前步骤的离心组织培养上清液，并在室温下孵育 1 小时。每 10 分钟摇动一次板，以避免在病毒吸收 1 小时后细胞干燥。从 MDCK 细胞中取出感染培养基，并加入两毫升 DMEM 0.3%BA 1%PS，每毫升含有 1 微克 TPCK 胰蛋白酶。

传代后 48 至 72 小时将在 MDCK 感染的细胞中观察到细胞病变效应。根据转染效率和病毒载量，细胞病变效应包括细胞四舍五入死亡和脱离表面等。接下来，从 MDCK 细胞中分离 snat 进行检测，以确认组织培养物中存在病毒。

上清液 以 13， 000 RPM 的转速微量离心上清液 1 至 2 分钟，以去除细胞碎片并转移到新的离心管中，以感染鸡胚蛋。使用轻质验蛋盒对 10 天龄的鸡蛋进行蜡烛照射，以查看气袋和 Allen Toic 腔之间的界面。用 5 毫升注射器针头在界面边界上做一个铅笔标记。

用 1 毫升注射器在蛋壳上打一个洞。用 200 微升先前的组织培养上清液感染每个鸡蛋。用棉签用融化的蜡盖住蛋壳上的孔。

在收集 Alan Toic 液体之前，将受感染的鸡蛋在 37 摄氏度下孵育 2 到 3 天。将鸡蛋在 4 摄氏度下孵育 2 小时或过夜，以杀死鸡胚并凝固血液。用 70% 乙醇清洗蛋壳以建立无菌条件。

用勺子敲击，小心地在气腔上打开鸡蛋。用镊子和一毫升针头取出破碎的蛋壳。去除 Alan Toic 膜，不要破坏蛋黄。

用刮刀稳定鸡胚，并将 10 毫升移液管引导至 Alan Toic 液体中。尽可能多地收集 Alan 到液体中。将 8 至 12 毫升倒入 15 毫升的冰离心管中，每个鸡蛋。

不要在 4 摄氏度下打破或收集任何蛋黄离心机五分钟，并将 Alan Toic 液体转移到冰上的新鲜 15 毫升离心管中，将装有离心机的管停放。Alan Toic 在 4 摄氏度液，直到通过 HA 检测检查是否存在拯救的病毒。HA 测定使用 VBO 96 孔板、使用 PBS one X 的阴性对照和组织培养的阳性对照进行。

旋后和或或 Alan Toic。来自非酒精流感病毒感染的液体应始终包含在 NAHA 测定中。将 50 微升 PBS 一 X 分配到 V 形底 96 孔板的每个孔中，从感染的鸡蛋中加入 50 微升 MDCK 组织培养上清液和/或 Alan Toic 液到第一个孔中，并为以下孔进行两倍连续稀释。

丢弃最后一个多余的 50 微升。向每个孔中加入 50 微升 0.5 至 1% 的鸡红细胞，将 V 形底 96 孔板在冰上孵育 30 至 45 分钟，或直至呈红色。在阴性对照 PBS 样品的底部可见，MDCK 组织培养上清液和/或感染鸡蛋的 LAN 液中存在病毒，可以使用鸡血凝素、红细胞在肉眼下确定。

病毒的存在会诱导血带凝集，而没有病毒则允许在孔底形成红色颗粒。此外，在感染组织培养上清液或鸡蛋中 LAN 毒液的细胞中存在 CPE 细胞从表面四舍五入的死亡分离等，这将表明在流感病毒的情况下病毒拯救呈阳性，大约需要 10 到 3 到 10 到四个噬菌斑形成单位或 pfu 才能在 HA 测定中给出阳性信号。因此，免疫荧光测定可以与 HA 测定同时进行，以确认真阴性结果。

由于可以通过用荧光标记的抗体对感染细胞进行染色来检测单个病毒颗粒的存在，因此在使用免疫荧光测定时，HA 阴性的上清液或 Alan Toic 液可能呈阳性。在这种情况下，应通过再次包装在 MDCK 细胞或鸡蛋中来扩增病毒。来自第二次传代的 Alan Toic 液体和/或组织培养上清液现在在 HA 测定中应该明显呈阳性。

我们刚刚向您展示了如何从质粒 DNA 中拯救缘绳病毒和流感病毒。从血浆 DNA 中拯救流感病毒是一个简单明了的过程。第一，该方案最初是在实验室完成的，用于从血浆 DNA 中拯救重组流感病毒。

我们建议每种重组病毒进行 3 次独立转染。如果尝试了多个重组流感病毒拯救，请根据要拯救的病毒数量相应地调整步骤。以下从血浆 DNA 中拯救重组流感病毒的转染和感染方案是六孔板的一项技能。

从受感染的鸡蛋中收集 LAN toic 液的所有程序均在无菌条件下进行。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。