Name: 经尿道诱导小鼠尿路感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解经尿道诱导小鼠尿路感染的标准化实验方法，包括细菌培养、膀胱接种、尿液及肾脏膀胱组织采集与菌落计数。该技术为研究尿路感染发病机制和评估抗菌治疗提供可靠的体内模型。

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作者谨此感谢 Shelly Xie 和 Jennifer Payne 提供的专业技术协助。本工作得益于小儿泌尿外科学会和斯坦福儿科研究基金的资助。

I. 尿道导管的制备
<ol>
	<li>对于每只小鼠的膀胱和肾脏样本，分别在一支冻存管中加入5-6颗不锈钢珠（膀胱：直径1.6 mm或0.9-2.0 mm的混合尺寸）或氧化锆珠（肾脏：直径0.5 mm）。对含有珠子的冻存管进行高压灭菌。</li>
	<li>待冻存管冷却至室温后，向每支含不锈钢珠的冻存管中加入200 µL无菌PBS，向每支含氧化锆珠的冻存管中加入400 µL无菌PBS。</li>
	<li>我们按照Hung和Hultgren13所述方法制备尿道导管。将一对洁净的平头镊子和精细剪刀（虹膜剪或类似类型）进行高压灭菌，并让器械冷却至室温。用70%乙醇擦拭超净工作台表面。在超净台内，截取一段约30 cm长的聚乙烯导管。将一支无菌30号针头（1/2英寸长）无菌地安装到一支无菌3 mL注射器上。用已灭菌的镊子夹住截好的聚乙烯导管一端，将其套入针头，直至导管接触针座。剪切导管，使其末端超出针尖约2 cm。将导管从注射器上取下，放入无菌培养皿中。</li>
	<li>为降低交叉污染的可能性，我们为每只小鼠单独制作一根导管。所有导管制备完成后，将培养皿敞开放置于紫外线下照射至少30分钟进行灭菌。紫外线灯开启时，切勿直视光源或暴露身体任何部位于超净台内。经紫外线灭菌后，导管可长期保存在培养皿中。建议用Parafilm密封培养皿，以维持无菌状态。</li>
</ol>
II. 动物接种
<ol>
	<li>小鼠应在实验操作前至少一周到达，以避免应激引起的混杂因素。选用雌性小鼠是因为雄性小鼠的尿道极难进行导管插入。CBA/J 是一种常用的、对尿路感染易感的近交系小鼠品系。小鼠的使用年龄应在 8 至 12 周之间，因为此阶段处于免疫系统成熟且尚未衰老的时间窗口。实验第一天，将无菌接种环末端浸入冻存细菌原液小瓶中，刮取少量接种物，并在适当的琼脂平板上划线接种。通常，尿路致病性 E. coli (UPEC) 及其他菌株可在Luria-Bertani (LB) 琼脂上过夜培养 37°C 在环境空气中。UPEC菌株在LB琼脂上生长为固体、淡黄白色半透明菌落。立即将菌种保存管放回冰箱冷冻。尿路致病性细菌菌株随着反复连续传代培养，其毒力可能逐渐减弱。因此，我们建议每次实验均划线接种新的琼脂平板。</li>
	<li>实验第2天，确认菌落形态正常后，从琼脂平板上挑取单菌落，接种于至少5 cc液体培养基中过夜培养。大多数尿路致病性细菌菌株可使用LB肉汤培养基37°C，200 转/分钟，室温空气中）。保持肉汤培养管的管盖松动，以利于通气。</li>
	<li>在实验第3天，取第一次肉汤培养物的10%，再次接种于肉汤中过夜培养（通常 37°C 并在200 rpm条件下培养，以增强I型菌毛的表达。连续肉汤培养有助于优化细菌的尿路致病性，因为I型菌毛已被证实是尿路致病菌的关键毒力因子。 体内1. 保持肉汤培养管的管盖松动，以利于通气。</li>
	<li>在实验第4天，测定OD值600 第3天肉汤培养物的稀释。如果待测菌株的稀释范围尚不明确，则使用磷酸盐缓冲液（PBS）进行至少7个对数级的十倍系列稀释，并在LB琼脂平板上培养， 37°C 孵育过夜）以确定 OD 之间的关系600 和 cfu/ml。作为经验法则，OD600 0.4–0.5 通常对应于 1–2×107 每 50 微升菌落形成单位（cfu）。一旦确定 OD 之间的关系600 且已确定cfu/ml后，可将肉汤培养物调整至OD600 对应于每只小鼠在50微升PBS中所需的菌落形成单位（cfu）。有研究提示，接种10微升而非50微升可减少向肾脏的反流6。然而，大多数文献报道仍采用每只小鼠50微升。通常，每只小鼠所需的cfu范围在106至108 cfu之间，但每种细菌/小鼠品系组合均需通过实验确定最佳接种量 体内.</li>
	<li>为确保接种物在灌注后不会立即被排出，应在诱导全身麻醉前至少30分钟使小鼠禁水。另一关键操作是在诱导麻醉前通过抓握小鼠颈背部皮肤并轻压下腹部，促使其排尿。对于8至12周龄的雌性CBA小鼠，2%至2.5%异氟烷是安全的诱导麻醉剂量，随后以1.8%至2%异氟烷维持麻醉。</li>
	<li>麻醉成功后，将小鼠置于仰卧位，头部插入连接含异氟烷氧气的鼻罩中。按摩下腹部以排空膀胱中的尿液。若膀胱相对空虚，此操作可能无法获取尿液。用70%乙醇浸润下腹部及会阴部。</li>
	<li>使用无菌的1毫升无针注射器吸取所需的细菌接种物。接着，将无菌尿道导管无菌地安装到注射器上。用剪刀剪去导管多余的管路，仅保留导管尖端远端1-2毫米的管段。然后将注射器直立，轻弹管壁并下压活塞，以彻底排除所有气泡。挤出少量抑菌润滑胶至无菌培养皿或无菌注射器包装内侧。将导管尖端（连同连接的注射器）浸入润滑胶中。若在同一实验中测试多种细菌菌株，需注意不可使用同一滴润滑胶来润滑含有不同菌株的导管。</li>
	<li>使用体视显微镜（放大倍数范围为0.8×至5×），用非优势手以一对细齿镊子轻轻夹住麻醉小鼠的阴蒂包皮，并向头侧提起，以暴露深粉色的尿道外口（图1）。用优势手以执笔式握持连接导管的注射器，将导管尖端以45度角插入尿道外口。沿注射器长轴方向牵拉阴蒂包皮，使尿道“套入”导管，此操作至关重要，因小鼠尿道存在冗余。导管应可顺利滑入膀胱（直至导管接头处，图2），可轻轻旋转导管以帮助通过尿道的冗余皱襞。导管插入至接头处后，将注射器放低至与小鼠体轴平行。非优势手松开镊子，协助固定导管和注射器位置，优势手则缓慢推注接种物（至少持续5秒）。若注射过程中观察到液体从导管周围溢出，则提示膀胱已充满或导管误入阴道（位于尿道稍尾侧）。此时应立即停止注射，并仔细检查导管位置。若导管曾进入尿道，则该小鼠不应纳入实验。反之，若导管误入阴道，可重新调整位置并再次尝试注射。注射完成后，缓慢将导管和注射器从小鼠体内撤出。</li>
	<li>为降低接种后早期排尿的可能性（早期排尿可能导致接种细菌被排出，从而引起感染水平的差异），部分研究者在经尿道接种后维持小鼠处于麻醉状态30分钟10。术后小鼠应在清洁的加热毯上恢复，并持续观察，以确认其恢复正常呼吸模式和活动能力。一旦动物完全恢复爬行能力，即可将其放回含有垫料的笼具中。</li>
</ol>
III. 检测感染组织中的菌落形成单位（CFU）
<ol>
	<li>已有多种关于小鼠尿路感染（UTI）的研究报道了接种后6小时至一周甚至更长时间的培养结果。每种细菌与小鼠品系组合的最佳时间点需通过实验经验确定。通过将小鼠抓起固定于无菌培养皿上方，收集其排尿样本进行培养。收集的尿液应始终置于冰上。可能需要在数小时内多次尝试获取排尿样本，因为小鼠排尿频繁、单次尿量少（每次排尿30–100微升），且受应激影响。</li>
	<li>获取排尿样本后，我们采用异氟烷麻醉并行颈椎脱位法处死小鼠。无菌打开腹部。若此前未能成功获取排尿样本，通常可使用30号针头和注射器经膀胱壁抽取少量尿液。</li>
	<li>取出一个或两个肾脏，在无菌培养皿上剪碎为至少4块（每块应小于50微克），并放入含氧化锆珠和PBS的冻存管中，置于冰上。取出膀胱，剪碎为至少4块，放入含不锈钢珠和PBS的冻存管中，置于冰上。将含组织、珠子和PBS的冻存管置于Bullet Blender匀浆仪中，以“8”档速度匀浆1分钟。匀浆后残留少量组织碎片是常见现象。只要能吸出50–100微升液体匀浆物，少量固体碎片通常不会影响实验。若需延长某些样本的匀浆时间，则必须对所有组织样本统一延长，以保持匀浆条件的一致性。我们选用Bullet Blender匀浆仪，因其可避免交叉污染，比使用常规匀浆器逐个处理样本更快速，且不会显著升高样本温度。</li>
	<li>应使用微量滴定板对收集的尿液和组织匀浆液进行至少两到三次十倍系列稀释。在初步实验中，建议至少进行七次十倍稀释。将最多100微升的尿液、膀胱和/或肾脏匀浆液接种至合适的琼脂培养基上。由于尿液样本体积可能有限，可在进行十倍稀释前将体积补足至100微升。若进行此操作，则初始稀释（十倍稀释前）的稀释倍数需计入最终细菌产量的计算中。我们倾向于将尿路致病性大肠杆菌（UPEC）接种于伊红美蓝琼脂或麦康凯琼脂上（37°C过夜培养），因为这些培养基对革兰阴性菌具有选择性。UPEC菌株因能够发酵乳糖，在麦康凯琼脂上形成中央凹陷、呈红粉色的菌落。</li>
	<li>过夜培养后，计数每块平板上的菌落形成单位（cfu）。对于系列稀释样本，菌落数在50–100之间的平板稀释度被认为计数最准确。据此“反推”计算每份组织、每毫克组织或每毫升中的cfu数量。</li>
</ol>
四、代表性结果

<img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="用于组织学分析的哺乳动物组织样本伤口；用于细胞研究的显微图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 用镊子将阴蒂包皮向头侧提起（超出照片顶部）后暴露的尿道外口（深粉色组织）

<img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="动物注射操作特写；注射器，实验，科研，生物医学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 插管的尿道。分叉的阴蒂可见于导管上方。
<img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="细菌计数图，cfu/ml，对数刻度，微生物分析，生长测定。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 8周龄雌性CBA/J小鼠经尿道感染尿路致病性E. coli后2天的膀胱cfu计数。取膀胱组织匀浆，通过在麦康凯琼脂平板上进行系列稀释涂布，测定cfu/ml。菱形符号表示每只小鼠的cfu/ml值，水平线表示中位cfu/ml。

<ol><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li>
<li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li>
<li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+LettM%22%5BJournal%5D)">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li>
<li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li>
<li>Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li>
<li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li>
<li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li>
<li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

通过经尿道接种细菌诱导小鼠尿路感染是一种历史悠久但技术要求较高的实验方法11。Hung 和 Hultgren 近期发表了一篇关于小鼠尿路感染经尿道技术的优秀综述13。本文旨在进一步阐明该实验方法的细节要点。

初学者可通过进行正中腹切开术暴露膀胱，注射稀释的印度墨水溶液（1% PBS 配制），并观察膀胱是否呈现蓝色染色，以此练习操作技术。我们发现，膀胱充盈是小鼠尿道注射过程中最难处理的问题之一，最好通过上述的限水及麻醉前排尿策略加以预防。在我们的操作中，&lt;10% 的小鼠在尿道注射过程中出现尿液溢出。另一个可能的难点是导管插入造成的创伤，可能导致尿道穿孔、膀胱接种物剂量不准确，甚至动物死亡。导管插入过程中，轻柔的操作和耐心至关重要；成功的导管插入绝不需要强行将导管推入膀胱。

最后，一些实验室可能由于样本数量较少或成本考虑，而不希望使用Bullet Blender匀浆器或其他“中通量”匀浆设备。一种折中方案是使用标准匀浆器，并在每个样本之间彻底清洗装置。最经济的方案是使用...

<table><tbody><tr><td>冻存管，2.0 ml 聚丙烯材质（无盖）</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>带&amp;rsquo;O&amp;rsquo;型密封圈的冻存管盖</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>子弹头组织研磨仪</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>氧化锆珠（0.5 mm）</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢珠（1.6 mm）</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢混合珠（0.9–2.0 mm）</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>CBA/J 小鼠，8–12 周龄雌性</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（NaCl 137 mM，KCl 2.7 mM，Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4.3 mM，KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1.4 mM）</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Aerrane）</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>伊红美蓝（EMB）琼脂粉末</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>麦康凯琼脂粉末</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂粉末</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>非射线不透性聚乙烯导管，Intramedic PE10 [内径 0.28 mm (0.011 英寸)；外径 0.61 mm (0.024 英寸)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>30 号针头，1/2 英寸</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 结核菌素 Slip-Tip 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 鲁尔锁注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

经尿道诱导小鼠尿路感染

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

感兴趣的尿路致病性细菌菌株在琼脂上培养。通常，尿路致病性E. coli(UPEC) 及其他菌株可在37°C的普通空气中，在Luria-Bertani (LB) 琼脂平板上过夜培养。UPEC菌株在LB琼脂上形成淡黄白色半透明菌落。在确认菌落形态合适后，挑取单个菌落进行液体培养。大多数尿路致病性细菌菌株均可使用LB液体培养基。可采用两轮连续的LB液体过夜培养，以增强I型菌毛的表达——这是尿路致病菌中一个明确的毒力因子。将液体培养物用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至所需浓度。将8至12周龄的雌性小鼠置于异氟烷麻醉下，使用带有聚乙烯管套的30号注射器经尿道接种细菌。通常的接种量需针对每种细菌/小鼠品系组合通过实验确定，一般为106至 108每只小鼠接种 10 至 50 微升 PBS 中的菌落形成单位（cfu）。在所需的感染期（一天至数周）后，收集尿液样本以及膀胱和双侧肾脏。将每个器官切碎后置于 PBS 中，并使用 Blue Bullet 匀浆器进行匀浆。尿液和组织匀浆液用 PBS 进行系列稀释，然后接种于适当的琼脂培养基上培养。次日，计数菌落形成单位。

本视频将演示经尿道诱导小鼠尿路感染的方法，并量化由此产生的感染程度。

感兴趣的尿路致病菌菌株在琼脂培养基上培养。通常，尿路致病性大肠杆菌（UPEC）及其他菌株可在琼脂培养基上过夜培养……

本实验的总体目标是通过经尿道途径诱导小鼠尿路感染。首先培养目标菌株，并将菌液稀释至所需浓度。实验的第二步是通过经尿道途径将目标菌株接种至小鼠膀胱内。该操作流程的第三步是收集尿液样本并收获肾脏和膀胱。该流程的最后一步是用尿液以及匀浆后的肾脏和膀胱样本接种螺旋平板。最终，可根据平板样本中是否存在细菌菌落来判断是否成功建立泌尿道感染。 大家好，我是 Michael Shea，欢迎来到我在斯坦福大学医学院泌尿外科系的实验室。我叫 Annu ti，也来自 Shea 实验室。今天我们将向大家演示小鼠经尿道插管的操作流程。我们在实验室中采用此方法研究小鼠尿路感染的诱导。现在开始操作。在超净工作台中，截取一段30厘米长的聚乙烯导管，将30号针头固定在一支无菌的3毫升注射器上。使用无菌镊子夹起切割后的导管一端，将其套入针头，直至与针座相接。剪裁导管，使其末端超出针尖约两厘米。此举有助于防止在小鼠插管过程中造成损伤。将导管从注射器上取下，并放入无菌培养皿中。为每只待感染的小鼠准备一根导管。用紫外线照射对导管进行灭菌，时间不少于30分钟。使用封口膜密封培养皿，以保持导管在长期储存期间的无菌状态。将目标细菌菌株的冻存菌种接种至合适的琼脂平板上进行划线。此处，将尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌种接种于平板，于37摄氏度培养过夜。挑选具有正确形态的单菌落，对于尿路致病性大肠杆菌（UPEC）而言，其在LB琼脂平板上表现为坚实的淡黄色、半透明菌落，将其接种至至少5毫升液体培养基中，在37摄氏度、200转/分钟振荡条件下过夜培养。将首次培养的菌液按10%体积比转接至新鲜培养基中，再次过夜培养。为增强与体内尿路致病性相关的I型菌毛表达，需测定菌液在600 nm处的光密度（OD 600），以确定菌落形成单位数量。每毫升培养液中菌落形成单位（CFU）的简写。用无菌的1×PBS稀释培养液，使最终浓度在每10至50微升含10⁶到10⁸个CFU之间，以确保接种物不会立即被排空。操作完成后，在麻醉前使小鼠禁水30分钟，抓住小鼠颈背部皮肤并轻轻按压下腹部，以促进排尿。将麻醉后的小鼠仰卧放置，头部插入连接含氧异氟烷的鼻罩中。按摩腹部，以排空膀胱内残留的尿液。使用喷雾瓶将下腹部和会阴部用70%乙醇浸湿。接下来，使用无菌的1毫升注射器吸取细菌接种物。将已准备好的无菌导管固定在注射器上。使用剪刀剪切导管，使其超出针尖仅1至2毫米。这有助于防止在导管插入过程中对小鼠造成损伤。轻敲注射器并推动推杆以排除气泡。通过将导管浸入一小团抗菌润滑胶中来润滑导管。在解剖体视显微镜下检测每种细菌菌株时，务必为每种菌株使用不同的胶团。用非惯用手持精细齿镊子轻轻夹住阴蒂包皮并提起，以暴露惯用手视野下深粉色的尿道口。握住连接导管的注射器，以执笔式手法将导管尖端以相对于小鼠腹部45度角插入尿道口。在正中矢状面。沿注射器的长轴牵拉阴蒂包皮。有效地将尿道套入导管。必要时，导管应能轻松滑入膀胱。可轻轻旋转导管以帮助通过尿道的冗余皱褶。当导管插入至接头处时，将注射器放低至与小鼠腹部平行。放下镊子，用非优势手固定导管和注射器。在至少五秒钟内缓慢注入接种物。如果在注射过程中看到液体沿导管周围流出，则表明膀胱已充满或导管位于阴道内。停止注射并检查导管位置。如有必要，重新调整导管在尿道中的位置。注射完成后，缓慢撤出导管。接种后使小鼠保持麻醉状态半小时。为降低术后排空的风险，将小鼠置于清洁的加热毯上恢复，并持续观察，以确认其恢复正常呼吸模式和活动能力。待其完全恢复、具备爬行能力后，将小鼠放回含有垫料的笼子中。根据细菌菌株和小鼠品系的不同组合，完全感染可能需要六小时到一周的时间。为进行实验，在数小时内，将每个感染小鼠对应的无菌培养皿置于冰上。抓住小鼠颈部皮肤，使其悬于培养皿上方，以收集用于培养的尿液。50 微升尿液应已足够。用移液器将尿液移入微量离心管中，盖上管盖，并将尿液置于冰上保存。在解剖显微镜下，将已处死的小鼠仰卧放置于解剖托盘上。用70%乙醇喷洒腹部。使用剪刀在皮肤及下方腹壁上做一个3至4厘米的切口。如有必要，使用针固定腹壁，使其与腹腔内容物分离。若先前的尿液采集尝试未成功，可使用30号针头和注射器通过膀胱壁直接抽吸尿液。用镊子和剪刀取出肾脏，转移至无菌培养皿中，并将每侧肾脏切成至少四块，每块大小约为2至3毫米。将每个肾组织碎片转移至含有5到6个无菌0.5毫米氧化锆珠和400微升无菌PBS的冻存管中。将肾组织样本置于冰上。使用镊子和剪刀去除膀胱。使用与肾脏相同的方法切碎膀胱组织。将每一块膀胱组织碎片转移至含有1.6毫米不锈钢珠和200 µL无菌PBS的冻存管中，并将管子置于冰上。将冻存管放入子弹式匀浆器中，在速度档位8下匀浆至少1分钟。匀浆后残留少量组织碎片是常见现象。所有样品均应在微量滴定板中进行相同时间的匀浆处理。用冰对收集的尿液和组织匀浆液进行连续十倍梯度稀释。冷PBS涂布。稀释完成后，将适当的平板置于37摄氏度过夜培养。可根据每个平板上的菌落数量反推出每器官、每毫克组织或每毫升尿液中的菌落形成单位（CFU）。我们一直采用这些技术来研究细菌应激反应中的突变如何影响尿路致病性大肠杆菌（UPEC）在体内引起尿路感染（UTI）的能力，以及其对给予感染小鼠的抗生素的耐受能力。此表格显示了通过经尿道接种后野生型UPEC感染小鼠膀胱的能力。我们刚刚向您展示了如何在小鼠中横向诱导尿路感染。进行此操作时，重要的是要轻柔地对小鼠进行导尿。正确的技术通常能够顺利实现导尿，但可能需要一定的练习。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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利用生物发光技术在小鼠模型中可视化尿路感染

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小鼠模型中的导管相关性尿路感染

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关键词：尿路感染，尿路致病性大肠杆菌，动物模型，小鼠，膀胱感染，肾盂肾炎，UTI模型，细菌感染，泌尿系统，实验方法

本视频展示了通过经尿道导管灌注在雌性小鼠膀胱中建立尿路致病性Escherichia...

经尿道插管与细菌接种建立雄性小鼠尿路感染模型

建立雌性小鼠尿路感染模型

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利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访

了解经尿道诱导小鼠尿路感染的标准化实验方法，包括细菌培养、膀胱接种、尿液及肾脏膀胱组织采集与菌落计数。该技术为研究尿路感染发病机制和评估抗菌治疗提供可靠的体内模型。

经尿道诱导小鼠尿路感染

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