Name: 机械性刺激，集成光学和原子力显微镜研究活细胞的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 了解原子力显微镜与光学成像联用技术，用于活细胞机械刺激研究。该方法可实时观察细胞骨架重组与黏附增强，为细胞力学和黏附机制研究提供精确工具。

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Vinculin-GFP 质粒由美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院牙科与颅面研究所 Kenneth Yamada 惠赠，actin-mRFP 质粒由美国佛罗里达州塔拉哈西市佛罗里达州立大学 Michael Davidson 惠赠。
本工作获得了 NSF 职业奖 #0747334 和美国心脏协会国家学者发展奖 #0835205N 对 Andreea Trache 的资助。

1. 集成显微镜系统的概述
用于这些研究的显微镜系统已有详细描述1。简而言之，该系统由一台配备全内反射荧光（TIRF）装置的倒置式 Olympus IX-81 显微镜（Olympus，美国宾夕法尼亚州森特瓦利）与 Yokogawa CSU-22 扫描头（Yokogawa Electric Inc，日本）组合而成。一台 Bioscope SZ 原子力显微镜（Veeco Instruments Inc，美国加利福尼亚州圣塔芭芭拉）安装在倒置光学显微镜上方，整个系统置于一张科研级光学平台（Newport，美国加利福尼亚州欧文）之上。
共聚焦组件由转盘扫描仪、外置滤光轮及其EMCCD相机（Roper Scientific-Photometrics，Tucson，AZ）组成，这些部件通过一块铝制基板刚性连接，基板置于硅胶垫上以实现减振。共聚焦扫描仪通过带螺纹卡环的法兰与显微镜连接，在进行原子力显微镜（AFM）测量时可将该连接断开，从而避免转盘扫描仪的振动影响AFM测量结果。采用氩-氪离子激光器（Spectra Physics，Mountain View，CA）作为全内反射荧光（TIRF）和共聚焦成像模式的激发光源，该激光器可交替耦合至两根光纤，分别将激光传输至TIRF附件或扫描头。系统由两台计算机控制：Slidebook软件控制光学成像，Nanoscope软件控制AFM。
2. 细胞培养
在进行机械刺激实验前24小时，应将表达靶向特定蛋白的GFP构建体的活细胞置于玻璃底细胞培养皿中。实验当天，将细胞培养基更换为不含酚红的培养基。将细胞培养皿用磁性卡环固定在原子力显微镜（AFM）载物台上。
3. 原子力显微镜探针制备与显微镜设置
将带有 2 微米生物素化玻璃珠的原子力显微镜（AFM）探针用 DPBS 洗涤五次，随后与亲和素（1 mg/ml）孵育 5 分钟，再用 DPBS 洗涤五次，接着与 1 mg/mL 生物素化纤连蛋白孵育 5 分钟。最后再洗涤五次2，将探针安装至 AFM 扫描器上，并将保护性硅胶裙边套在探针夹具周围。设置显微镜的视频观察模式，使 AFM 探针位于视野中央。通过将激光束对准悬臂末端来校准光学杠杆系统，然后更换为适用于单细胞成像的高倍物镜。实验开始前必须测定探针的弹簧常数，该参数将使用 Nanoscope 软件中的热调谐法进行测量。从视频相机切换至 EMCCD 相机，以实现荧光成像。选择一个细胞，并使 AFM 探针与其表面特定位置接触。等待 20 分钟，以确保在 AFM 探针与细胞表面接触点处形成牢固的局灶性黏附，随后开始机械刺激程序。
4. 活细胞的机械刺激
全内反射荧光成像（TIRF）3-4 将作为可视化和定量局灶性黏附的首选方法，而转盘共聚焦成像5将用于在整个细胞体中观察肌动蛋白细胞骨架。原子力显微镜（AFM）6将在液体环境中以接触模式成像使用。
在开始机械刺激程序之前，将获取细胞的全内反射荧光（TIRF）或共聚焦图像。机械刺激由功能化的原子力显微镜（AFM）探针诱导，该探针将在一段时间内（1-1.5小时）每隔3-5分钟向上移动一个离散步长。细胞的反应将通过Nanoscope软件连续记录为一系列高度图像，图像中的每一行代表1秒的时间单位。在采集AFM数据的同时，操作人员需持续监测AFM针尖的z轴位置，以确定下一次牵拉的合适时机。
每次机械刺激后，可在 Slidebook 软件中获取细胞的 TIRF 或共聚焦图像，同时持续采集 AFM 数据。光学图像可离线处理，生成显示肌动蛋白细胞骨架和黏着斑重组过程的视频。此外，每幅图像还可进行定量分析，以确定细胞面积、特定蛋白区域面积，并分析细胞的整体形态。
实验结束时，将原子力显微镜探针从细胞中撤回，并在Nanoscope软件中测量探针的灵敏度。
该实验对噪声非常敏感！实验过程中应避免任何交谈或触碰显微镜。为了最大限度减少原子力显微镜（AFM）测量中的噪声，需将转盘共聚焦装置与显微镜解耦。细胞表面与AFM探针之间形成稳定黏着斑所需的等待时间，可能因所用细胞类型及探针上包被的基质材料而异。
5. 典型结果
<img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="经荧光染色显示细胞骨架结构的细胞显微图像，突出显示蛋白质" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 同一株转染了肌动蛋白-mRFP 和连环蛋白-GFP 的血管平滑肌细胞（VSMC）通过以下方式成像：（A）原子力显微镜（AFM）在细胞顶面成像；（B）全内反射荧光显微镜（TIRF）在细胞基底面成像；（C）转盘共聚焦显微镜在整个细胞体中成像。 共聚焦图像显示为三维图像堆栈的最大投影。AFM 图像与 TIRF 图像或转盘共聚焦图像之间的良好重叠分别显示在 (D) 和 (E) 中。图像尺寸为 64 × 50 µm。
<img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="细胞肌动蛋白丝动态的延时成像，荧光显微镜，0-66 分钟分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 一株转染了肌动蛋白-mRFP 的血管平滑肌细胞（VSMC）被原子力显微镜（AFM）进行机械刺激，并通过转盘共聚焦显微镜成像。 箭头指示肌动蛋白纤维的变化：(a) 聚合/增厚，(b) 去聚合/消失，或 (c) 因肌动蛋白重构而聚集束化。白色虚线表示位于细胞上方的 AFM 探针。图像尺寸为 91 × 91 µm。

<ol><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

细胞骨架7-10和黏着斑11-16是动态结构，会随着细胞迁移或响应机械力而组装、解聚和更新17。它们在调控细胞生长、存活和基因表达方面具有重要功能。了解它们的特定分布和动态变化，有助于更好地理解细胞如何与基质以及细胞之间进行通讯。
该新型显微镜系统可广泛应用于各种贴壁活细胞的分子动力学研究。集成显微镜能够对亚细胞水平的快速变化进行定量监测，为理解细胞在机械力作用下发生重塑的基本过程提供了一种重要的新型工具。

<table><tbody><tr><td>AFM 探针</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td></td><td>2 微米硼硅酸盐微珠，0.01 N/m，生物素表面</td></tr><tr><td>亲和素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td>DPBS 中 1 mg/mL</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-051</td><td></td></tr><tr><td>平滑肌细胞 Amaxa 转染试剂盒</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>Mattek 培养皿（玻璃底）</td><td>MatTek Corp.</td><td>P60G-1.5-30-F</td><td>无菌 60 mm Falcon 培养皿，带 1.5 号盖玻片玻璃底</td></tr></tbody></table>

活细胞对机械刺激响应的集成光学与原子力显微镜研究

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

为了理解活细胞感知机械力的机制，以及它们如何响应并适应其环境，研究人员开发了一种新技术，能够在亚细胞水平上以高空间和时间分辨率研究细胞行为。该技术将原子力显微镜（AFM）与全内反射荧光（TIRF）显微镜以及高速旋转盘共聚焦显微镜（FSD）相结合。这一集成系统可广泛应用于各种贴壁活细胞中的分子动态研究，实现对细胞在机械刺激下实时响应的直接光学成像。实验结果显示，在细胞顶面施加局部机械刺激后，细胞内的肌动蛋白纤维和黏着斑发生了显著重排，并引起整个细胞体内部结构的改变。这些创新性技术将为理解活细胞在机械力作用下的重构过程与动态变化提供新的信息。本文同时提供了一份详细的实验方案及一组代表性数据，展示活细胞对机械刺激的响应过程。

本文旨在指导读者使用集成的原子力-光学成像显微镜对培养中的活细胞进行机械刺激操作。文中提供了一步一步的操作方案，并展示了一组典型的实验数据，用以显示活细胞对机械刺激的响应。

为了理解活细胞感知机械力的机制，以及它们如何响应并适应所处环境，一种能够……的新技术

通过以下步骤实现对细胞在机械刺激下实时反应的研究：首先，将表达GFP融合蛋白的细胞在玻璃底培养皿中培养24小时。第二步是用生物素化的纤连蛋白包被原子力显微镜（AFM）探针。随后，将功能化的AFM探针与细胞表面接触，使探针周围形成牢固的局灶性黏附，从而通过包被纤连蛋白的探针与细胞之间的基质整合素-肌动蛋白连接，直接操控肌动蛋白细胞骨架。最后一步是通过控制原子力显微镜（AFM）探针的向上移动，对活细胞施加机械刺激，使垂直方向的力作用于细胞接触点，同时不破坏牢固的黏着斑。最终结果显示，细胞会对机械刺激产生响应，通过增强其与基底的黏附以及诱导肌动蛋白细胞骨架的重组来适应刺激，这些变化可通过实时荧光光学成像记录到。大家好，我是安德烈亚·特雷克（Andrea Trake），德克萨斯农工健康科学中心系统生物学与转化医学系的助理教授。大家好，我是Sum Lim。我是德克萨斯农工健康科学中心系统生物学与转化医学系的博士后研究员。今天我们将向您展示一种研究细胞对机械刺激产生适应性重塑的方法。我们在实验室中采用此方法研究活体血管平滑肌细胞中细胞骨架的实时重塑过程。现在让我们开始吧。在这些研究中，使用配备全内反射荧光（TIRF）装置以及Yokogawa CSU-22扫描头的倒置Olympus IX81显微镜。一台生物显微镜SZ型原子力显微镜安装在倒置光学显微镜上方。整个系统安装在科研级光学平台上，此前已有详细描述。该集成显微镜使用两台QuantEM电子倍增电荷耦合器件（electron multiplying charge coupled device，E-M-C-C-D）相机。一个用于草坪成像，另一个用于共聚焦成像。共聚焦组件由旋转盘扫描仪、外置滤光轮和电子倍增CCD相机组成，安装在铝制基板上，基板置于硅胶垫上方，以实现减振。整个共聚焦组件通过带螺纹卡口的法兰连接至显微镜。因此，在进行原子力显微镜或调频测量时，可将该组件从显微镜上拆下，以避免旋转盘扫描器产生的振动。使用氩氪激光器作为明场和共聚焦成像模式的激发光源。该激光器可耦合至两根光学纤维中的任意一根，将激光传输至明场附件或共聚焦扫描头。两台计算机控制系统。其中一台使用幻灯片成像软件，用于控制光学成像；另一台使用纳米显微软件，用于控制原子力显微镜。在进行机械刺激实验前24小时，将表达靶向特定蛋白的GFP构建体的活细胞置于玻璃底细胞培养皿中。实验当天，将细胞培养基更换为不含酚红的培养基。由于调频（FM）实验对噪声非常敏感，实验过程中应避免说话或触碰光学平台或显微镜，以尽量减少噪声干扰。在调频（FM）测量中，需将转盘共聚焦装置与显微镜解耦。实验开始时，将细胞培养皿放置在调频（FM）显微镜载物台上，并使用磁性卡环将培养皿固定在磁性显微镜载物台上。AFM探针上的V形悬臂经过定制，末端带有两个微米级的生物素化玻璃小球。使用显微镜可轻松观察到该悬臂。小球被粘附在悬臂的最末端，此处即为涂层溶液应逐滴施加的位置。为实验准备FM探针时，首先将探针尖端安装到玻璃支架中，然后将玻璃支架置于台式支架上以进行尖端包被。用移液器小心地在探针尖端末端滴加10微升二十二烷基磷酸盐缓冲液（DPBS），以清洗尖端，随后使用无尘纸将尖端擦干。使用浓度为每毫升一毫克的DPBS溶液清洗后，重复此清洗和干燥步骤五次。将链霉亲和素溶液滴加至枪头尖端，逐滴加入。在链霉亲和素包被后，使枪头尖端在溶液中孵育五分钟。用DPBS再清洗尖端五次。然后通过将一毫克每毫升的溶液逐滴加入尖端，并孵育五分钟，将生物素化的纤连蛋白交联到avadon上。最后，用DPBS再次清洗探针尖端5次，每次清洗后均在尖端留下最后一滴。探针制备完成后，将其安装到FM扫描仪上。安装FM探针后，在探针 holder 周围套上保护性硅胶裙边。然后设置用于视频观察的显微镜。接下来，将FM探针尖端对准视野中心。通过将激光束对准悬臂末端来设定光杠杆。然后将物镜切换至适用于单细胞成像的合适高倍物镜。接着，将待进行机械刺激的细胞移入视野，并选择原子力显微镜（AFM）针尖应接触细胞表面的位置。最后，降低AFM针尖，直至其接触该特定细胞表面。将探针尖端与细胞接触后，等待约 20 分钟。这有助于在细胞表面的原子力显微镜接触点处形成牢固的黏着斑。等待时间结束后，可开始进行机械刺激实验的准备工作。从视频摄像机切换到EMCCD相机，以便观察并成像荧光细胞。然后获取静息状态下细胞的初始图像。使用转盘共聚焦显微镜和共聚焦显微技术对细胞整体内的肌动蛋白细胞骨架进行可视化观察。相反，使用turf来可视化局灶性黏附，以刺激细胞。利用悬臂每三到五分钟以离散的步进方式施加一次受控的向上移动。在采集原子力显微镜（AFM）数据时，操作者必须持续监测Z压电位置的电压，以确定垂直杆操作的合适时机。在每次垂直拉伸后，使用SlideBook软件同步记录FM数据采集以及细胞的共聚焦或转盘显微图像。刺激实验完成后，最终将FM探针从细胞中撤出。该血管平滑肌细胞转染了肌动蛋白MRFP和vcul。使用FM在细胞顶面成像GFP。同一细胞在细胞底面使用turf进行成像。此处将两幅图像叠加显示。同一细胞的图像还通过转盘共聚焦显微镜在整个细胞体上获取，并显示为三维图像堆栈的最大投影。原子力显微镜（AFM）图像与转盘共聚焦图像之间显示出良好的重叠。该血管平滑肌细胞转染了肌动蛋白MRFP，通过原子力显微镜（AFM）进行机械刺激，并利用转盘共聚焦显微镜成像。这些误差表明，在FM刺激下表现出显著重构的肌动蛋白纤维。一些肌动蛋白纤维发生聚合，而另一些则因机械刺激而解聚，还有一些肌动蛋白纤维相互成束。由于肌动蛋白的重构，我们刚刚向您展示了如何使用EFM对活细胞培养物进行机械刺激，同时利用光学成像方法记录细胞骨架的重排过程。进行此操作时，重要的是要记住，FM 实验具有极强的噪声且非常敏感。就这些。感谢您的观看，祝您在陈述中取得成功。

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