活细胞对机械刺激响应的集成光学与原子力显微镜研究

通过以下步骤实现对细胞在机械刺激下实时反应的研究：首先，将表达GFP融合蛋白的细胞在玻璃底培养皿中培养24小时。第二步是用生物素化的纤连蛋白包被原子力显微镜（AFM）探针。随后，将功能化的AFM探针与细胞表面接触，使探针周围形成牢固的局灶性黏附，从而通过包被纤连蛋白的探针与细胞之间的细胞外基质整合素-肌动蛋白连接，直接操控肌动蛋白细胞骨架。

最后一步是通过控制原子力显微镜（AFM）探针的向上移动，对活细胞施加机械刺激，使垂直方向的力作用于细胞接触点，同时不破坏牢固的黏着斑。最终结果表明，细胞通过增强其与基底的黏附以及诱导肌动蛋白细胞骨架的重组来响应机械刺激，这些变化可通过实时荧光光学成像记录得到。大家好，我是安德里亚·特雷克（Andrea Trake），来自德克萨斯农工健康科学中心系统生物学与转化医学系，担任助理教授。

您好，我是Sum Lim。我在德克萨斯农工健康科学中心系统生物学与转化医学系担任博士后研究员。今天我们将向您展示一种研究细胞对机械刺激产生适应性重塑的实验方法。

我们在实验室中采用此方法研究活体血管平滑肌细胞中细胞骨架的实时重塑过程。现在让我们开始吧。在这些研究中，使用配备全内反射荧光（TIRF）装置以及 Yokogawa CSU-22 扫描头的倒置 Olympus IX81 显微镜。

一台生物型 SZ 原子力显微镜安装在倒置光学显微镜上方。整个系统安装在研究级光学平台上，此前已有详细描述。该集成显微镜使用两个 QuantEM 电子倍增电荷耦合器件（E-M-C-C-D）相机。

一个用于宽场成像，另一个用于共聚焦成像。共聚焦组件由旋转圆盘扫描仪、外置滤光轮和电子倍增CCD相机组成，安装在置于硅胶减震垫上的铝制基板上。整个共聚焦组件通过带螺纹卡口的法兰连接到显微镜。

因此，在进行原子力显微镜或调频测量时，可将该组件从显微镜上拆下，以避免旋转盘扫描器产生的振动。采用氩氪离子激光器作为明场和共聚焦成像模式的激发光源。该激光器可耦合至两根光学纤维中的任意一根，将激光传输至明场附件或共聚焦扫描头。

两台计算机控制系统。其中一台使用幻灯片成像软件，用于控制光学成像；另一台使用纳米显微软件，用于控制原子力显微镜。在进行机械刺激实验前24小时，将表达靶向特定蛋白的GFP构建体的活细胞置于玻璃底细胞培养皿中。实验当天，将细胞培养基更换为不含酚红的培养基。

由于原子力显微镜（AFM）实验对噪声非常敏感，实验过程中应避免说话或触碰光学台或显微镜，以尽量减少噪声干扰。在AFM测量过程中，需将转盘共聚焦装置与显微镜分离。实验开始时，将细胞培养皿安装在AFM载物台上，并使用磁性卡环将培养皿固定在磁性显微镜载物台上。

原子力显微镜探针上的V形悬臂经过定制，末端带有两个微米级的生物素化玻璃小球。使用显微镜可轻松观察到该悬臂。小球被粘附在悬臂的最末端，此处即为应逐滴施加包被溶液的位置。

为实验准备FM探针时，首先将探针尖端安装到玻璃支架中，然后将玻璃支架置于台式支架上以进行尖端镀膜。通过在探针尖端末端小心滴加10微升二十二烷基磷酸盐缓冲液（docos phosphate buffered saline，DPBS）来清洗尖端，随后使用无尘纸（kim wipe）将尖端擦干。使用浓度为每毫升一毫克的DPBS清洗后，重复此清洗和干燥步骤五次。

将Avid溶液滴加至尖端，逐滴加入。Avid包被后，让尖端在溶液中孵育五分钟。

用DPBS再清洗尖端五次。然后通过将一毫克每毫升的溶液逐滴加入尖端，并孵育五分钟，将生物素化的纤连蛋白交联到avadon上。

最后，用DPBS再次清洗探针尖端5次，每次清洗后将最后一次的液滴保留在尖端上。探针制备完成后，将其安装到FM扫描仪上。安装FM探针后，在探针 holder 周围放置一个保护性的硅胶裙边。

然后设置用于视频观察的显微镜。接下来，将FM探针尖端对准视野中心。通过将激光束对准悬臂末端来设定光杠杆。

然后将物镜切换至适用于单细胞成像的合适高倍物镜。接着，将待进行机械刺激的细胞移入视野，并选择原子力显微镜（AFM）针尖应接触细胞表面的位置。最后，降低AFM针尖，直至其接触该特定细胞。

将探针尖端与细胞接触后，等待约 20 分钟。这有助于在细胞表面的原子力显微镜接触点处形成牢固的局灶性黏附。等待期结束后，可开始进行机械刺激实验的准备工作。

将摄像设备从普通视频相机切换至电子倍增电荷耦合器件（E-M-C-C-D）相机，以便观察并成像荧光标记的细胞。随后采集细胞静息状态下的初始图像。利用转盘共聚焦显微镜和共聚焦显微技术，对细胞整体内的肌动蛋白细胞骨架进行可视化观察。

相反，使用turf来可视化局灶性黏附以刺激细胞。利用悬臂每三到五分钟以离散的步进方式施加可控的向上移动。在采集原子力显微镜（AFM）数据的同时，操作者必须持续监测Z压电位置的电压，以确定垂直杆操作的合适时机。

在每次垂直拉伸后，使用SlideBook软件同步记录FM数据采集以及细胞的共聚焦或转盘显微图像。刺激实验完成后，最终将FM探针从细胞中撤出。一个血管平滑肌细胞转染了肌动蛋白MRFP和vcul。

使用荧光显微镜在细胞顶面观察GFP。同一细胞在细胞底面使用turf进行成像。此处将两幅图像叠加显示。

同一细胞的图像还通过转盘共聚焦显微镜在整个细胞体上获取，并显示为三维图像堆栈的最大投影。原子力显微镜（AFM）图像与转盘共聚焦图像之间显示出良好的重叠。该血管平滑肌细胞转染了肌动蛋白MRFP，通过原子力显微镜（AFM）进行机械刺激，并利用转盘共聚焦显微镜成像。

这些误差表明，在FM刺激下表现出显著重构的肌动蛋白纤维。一些肌动蛋白纤维发生聚合，而另一些则因机械刺激而解聚，还有一些肌动蛋白纤维则相互成束。由于肌动蛋白的重构，我们刚刚向您展示了如何使用EFM对活细胞培养物进行机械刺激，同时利用光学成像方法记录细胞骨架的重排过程。

进行此操作时，重要的是要记住，FM 实验噪声极大且非常敏感。就这些。感谢您的观看，祝您实验顺利。