Name: 定向脑深部结构与配送药品，病毒载体，或细胞移植Microinjections (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-01T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学习使用50微米内径玻璃毛细管针进行脑深部微注射技术，实现药物、病毒载体或细胞移植的精准递送。该方法可显著减少脑损伤并提高靶向精度，适用于啮齿类动物模型的神经科学研究。

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O.G-P 得到 CONACyT 资助（CB-2008-101476）和 FRABA（686/10）的支持。A.Q-H 得到美国国立卫生研究院、霍华德·休斯医学研究所、罗伯特·伍德·约翰逊基金会以及马里兰干细胞基金会的支持。

<ol>
 <li>在小鼠手术前制备玻璃针：
 <ol class="lalpha">
 <li>将毛细玻璃管放入微电极拉制仪中。</li>
 <li>加热玻璃管中部，使局部区域的玻璃软化。</li>
 <li>沿玻璃管的纵向轴向拉伸，初始拉伸距离需足以使局部区域的玻璃管直径减小。</li>
 <li>持续拉伸玻璃管直至其断裂，从而获得两根相同的单通道针头。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>将玻璃针放入微针成型仪中，以30°角对针尖进行斜面打磨。</li>
 <li>在显微镜下检查每根针头是否具有正确的内径；对于大多数亲水性药物，30–50 μm 的内径最为理想（图1）。</li>
 <li>从玻璃针最宽的一端注入矿物油。让矿物油（MSDS, Cat. M7700）通过毛细作用进入，直至达到毛细管长度约50%的位置。在推杆周围涂抹高真空润滑脂（Dow Corning, Cat. 05054-AB），以密封针的最宽端。</li>
 <li>从玻璃针最宽端插入推杆，轻柔推动矿物油，直至针尖处出现一小滴油珠。</li>
 <li>将玻璃针牢固固定在微量注射器的针 holder 中。</li>
 <li>以2.5% Avertin（2,2,2-三溴乙醇 + 叔戊醇，1:1 w/v）对小鼠进行麻醉，剂量为25–30 μL/克体重，腹腔注射。</li>
 <li>在立体定位仪上放置加热垫，以维持动物体温在37°C。</li>
 <li>使用耳杆和门齿固定器将小鼠头部固定于立体定位仪中。</li>
 <li>用0.1% 氯己定葡糖酸盐溶液清洁小鼠头部，随后用70% 乙醇擦拭，再重复一次0.1% 氯己定葡糖酸盐溶液消毒。</li>
 <li>使用#15外科刀片从小鼠耳部沿至颅骨Lambda线作皮肤切口。</li>
 <li>用棉签擦拭颅骨以使其干燥，并将皮肤移出手术区域。</li>
 <li>使用玻璃针针尖定位Bregma缝合线的顶点，在此设定注射器的初始位置（即“零”坐标）。</li>
 <li>通过移动立体定位仪的“X”和“Y”轴，确定钻孔位置。</li>
 <li>在选定坐标处小心钻孔。微型钻头及其他金属工具需预先在干式玻璃珠灭菌器（Cole Palmer, Cat. No. EW-10779-00）中于250°C灭菌60秒。</li>
 <li>用精细镊子小心去除最深层的骨组织，并刺破硬脑膜（可见脑脊液渗出）。</li>
 <li>确认玻璃针可顺利通过钻孔。</li>
 <li>吸取1 μL待注射药物，并滴加至一小片Parafilm上。</li>
 <li>将Parafilm放置于颅骨上。</li>
 <li>旋转微量注射器旋钮吸取药物，同时在显微镜下观察液体是否进入玻璃针内。</li>
 <li>移除Parafilm并重新设定“零”坐标。</li>
 <li>将针移动至选定坐标，下移针 holder，使玻璃针针尖轻触脑表面，并将“Z”坐标设为零。</li>
 <li>将玻璃针插入脑实质至预定深度。</li>
 <li>以约1 nl/sec的速度缓慢注射药物。</li>
 <li>当注射达到目标体积后，让药物在脑实质内扩散2分钟，随后缓慢平稳地拔出针头。</li>
 <li>缝合手术切口，将动物从立体定位仪中取出，并放入预热的笼子中，笼内铺有干净垫料以供麻醉恢复。</li>
 <li>所有动物术后均接受5 mg/kg酮咯酸（Ketorolac）皮下注射，每12小时一次，持续24小时，以提供术后镇痛。</li>
</ol>
代表性结果：
按照本方案操作，可实现精确注射，且极细的针道可最大限度减少脑组织损伤。作为该方法的代表性结果，我们将溶血磷脂酰胆碱（lysolecithin）注射至胼胝体，以诱导白质纤维束脱髓鞘，相关研究见文献1-4。为尽量减少玻璃微针造成的脑损伤，我们仅向胼胝体注射20 nl溶血磷脂酰胆碱；但如有需要，采用相同方法亦可注射高达200 nl的体积。脱髓鞘现象可通过白质纤维束中髓鞘碱性蛋白表达缺失来检测（图2）。
<img src="/files/ftp_upload/2082/2082fig1.jpg" alt="光学衍射图样、光束、物理实验、测量刻度、激光衍射。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 直径为50-μm的玻璃针。刻度上两条短刻度线之间的距离代表50-μm的长度。
<img src="/files/ftp_upload/2082/2082fig2.jpg" alt="显示脑组织中皮层和胼胝体区域的荧光显微镜图像" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 胼胝体内的溶血卵磷脂注射。脱髓鞘表现为无髓鞘碱性蛋白表达区域（虚线区）。注意玻璃针穿刺轨迹较小（箭头所示）。标尺 = 100 μm

<ol><li>Menn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+oligodendrocytes+in+the+subventricular+zone+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain.</a> J Neurosci. 26, 7907-7918 (2006).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Romero-Rodriguez, R., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Growth+Factor+Induces+the+Progeny+of+Subventricular+Zone+Type+B+Cells+to+Migrate+and+Differentiate+into+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal Growth Factor Induces the Progeny of Subventricular Zone Type B Cells to Migrate and Differentiate into Oligodendrocytes.</a> Stem Cells. 27, 2032-2043 (2009).</li>
<li>Hall, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+aspects+of+remyelination+after+demyelination+produced+by+the+intraneural+injection+of+lysophosphatidyl+choline%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Some aspects of remyelination after demyelination produced by the intraneural injection of lysophosphatidyl choline.</a> J Cell Sci. 13, 461-477 (1973).</li>
<li>Webster, G. R., Thompson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+presence+of+lysolecithin+in+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Observations on the presence of lysolecithin in nervous tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 63, 38-45 (1962).</li>
<li>Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+Zone+Astrocytes+Are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subventricular Zone Astrocytes Are Neural Stem Cells in the Adult mammalian Brain.</a> Cell. 97, 1-20 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+converts+transit-amplifying+neurogenic+precursors+in+the+adult+brain+into+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells.</a> Neuron. 36, 1021-1034 (2002).</li>
<li>Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 15472-15477 (2009).</li>
<li>Richardson, R. M., Barbaro, N. M., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+cell+transplantation+for+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Focus%22%5BJournal%5D)">Developing cell transplantation for temporal lobe epilepsy.</a> Neurosurg Focus. 24, E17-E17 (2008).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26, 7380-7389 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本视频展示的方法对于将大多数药物或病毒载体递送至大脑的特定位置非常有用。该技术的主要优势包括靶点定位的可靠性、注射的精确性以及脑部损伤和通路损伤的范围较小1, 2, 5, 6。一旦该技术实现标准化，靶向误差范围应控制在50 μm或更小1, 2。细胞移植也可通过使用更宽的针头（直径100–150 μm7–9）完成。因此，可将细胞高效地递送至特定病灶区域，从而最大限度减少细胞移植所引起的附带损伤。该技术包含三个关键步骤： <ol> <li>我们始终建议在钻孔前，先用胰岛素针头轻轻划擦颅骨，以标记选定的坐标位置。</li> <li>迅速插入玻璃针头，快速穿透脑表面。</li> <li>到达最佳深度后，应将针头再深入脑实质0.1 mm，以形成一个“通道”，使药物能够自由扩散进入脑组织。</li> </ol>

<table><tbody><tr><td>毛细玻璃管</td><td>Wiretrol I</td><td>5-000-1001</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 730</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Model 48000</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>MSDS</td><td>M7700</td><td></td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>Dow Corning</td><td>05054-AB</td><td></td></tr><tr><td>麻醉剂：2.5% Avertin</td><td></td><td></td><td>2,2,2-三溴&amp;#8211;乙醇 + 叔戊醇，1:1 w/v</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Mastex</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model Kopf-900</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 #15</td><td>Medi-Cut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型钻机</td><td>Ideal Micro Drill</td><td>67-1000</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-&amp;mu;L 微量移液器</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Vasiorkop 配 Contraves 系统</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>Narishige International</td><td>Model MO-10</td><td></td></tr></tbody></table>

通过微注射靶向递送药物、病毒载体或细胞移植物至脑深部结构

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

向脑实质内进行微量注射是递送药物、病毒载体或细胞移植的重要操作步骤。注射针在穿刺过程中造成的脑组织损伤是一个主要问题，尤其是在小鼠脑中，不仅因为脑体积较小，有时还需进行多次注射。本文介绍一种制备内径为50 μm玻璃毛细管针的方法，可显著减少脑组织损伤，并实现对啮齿类动物脑部的精确定位。该方法可递送小体积液体（20至100 nl），降低出血风险，并最大限度减少药物在脑实质中的被动扩散。通过使用不同规格的玻璃毛细管或调整针头内径，可注射多种类型的物质和细胞。采用玻璃毛细管进行微量注射代表了注射技术的重要改进，可在小型啮齿类动物中实现深部脑区靶向递送，同时将附带损伤降至最低。

关键词：微量注射，脑实质，玻璃毛细管针，内径，药物递送，病毒载体，细胞移植，脑损伤，小鼠脑，啮齿类动物，深部脑区靶向

本文介绍一种制备内径为50 μm玻璃毛细管针的方法。该技术可显著减少脑组织损伤，最大限度降低药物的被动扩散，并实现对啮齿类动物脑部的精确定位给药。

向脑实质内进行显微注射是递送药物、病毒载体或细胞移植的重要操作步骤。该操作所造成的脑损伤……

本实验的总体目标是向深部脑结构进行高精度的微量注射，以递送药物、病毒载体或细胞移植物。该操作首先制备内径为50微米的玻璃毛细管针头；第二步是通过毛细作用使矿物油填充针头的50%，然后从管子的较宽一端插入推杆。该操作步骤的第三步是将需要注射的物质或细胞悬液吸入针头中。最后一步是将针尖插入脑深部结构，并以极低的流速注入该物质。最终可获得结果，显示通过玻璃毛细管进行微量注射，能够将物质非常精确地靶向递送至脑内特定区域。您好，我是来自墨西哥科利马大学心理学学院神经科学实验室的 Oscar Gonzalez。今天，我们将向您展示一种使用玻璃毛细管进行脑内药物微注射的操作方法，用于将药物递送至小鼠脑内。我们在实验室中广泛采用该技术来研究成年哺乳动物的神经干细胞。那么我们开始吧。使用内径为50微米的玻璃毛细注射针向脑内进行微注射可显著减少脑组织损伤，最大限度降低药物的被动扩散，并实现对啮齿类动物脑部的精确定位给药。在进行微注射之前，必须先制备玻璃注射针。首先将毛细玻璃管放入微量移液器拉制仪的高阻电极中。然后开启微量移液器拉制仪的电极。通过沿玻璃管的纵向轴向拉伸三至五毫米的初始距离，使玻璃管中部受热，局部软化玻璃管，从而足以导致玻璃管局部区域的直径减小。继续拉伸玻璃管直至其断裂。重复上述步骤，制备两根相同的单通道针头。现在将玻璃针头放入显微拉制仪中。30度的角度足以使针尖形成斜面。最后，将针头置于显微镜下检查，确保两根针头均具有正确的内径。对于大多数亲水性药物而言，使用内径为30至50微米的针头最为理想。让我们看看如何将它们用于显微注射。首先，从最宽的一端向制备好的针头中填充矿物油。让矿物油通过毛细作用进入，直至达到毛细管长度的约50%。在针头最宽的一端涂抹高真空润滑脂，并将推杆由此端插入。轻轻推动矿物油，直至玻璃针尖端有微小液滴渗出。随后将针头固定在显微注射仪的针座中，并开始准备动物以进行注射。首先，在立体定位动物固定装置上放置加热垫以维持动物的体温。在37摄氏度下，剃除麻醉小鼠头部的毛发，然后将其头部放入立体定位仪中并固定。使用耳杆和门齿固定器固定头部，用手术刀从耳部沿颅骨Lambda线切开皮肤。用棉签擦拭颅骨以使其干燥，并将皮肤拉出手术区域。接下来，用玻璃针的尖端指向顶骨中线与矢状缝交点（bgma缝的顶点），并在此处设定注射的初始位置。现在通过移动立体定位仪的X轴和Y轴，将颅骨上需要钻孔的位置调整至对应点。使用科研用微型钻，在选定坐标处用精细镊子小心钻孔。小心移除最深层的骨组织并刺破现代硬脑膜。此时将可见少量脑脊液渗出。为确认针头能够穿过钻好的孔，使用立体定位仪的Z轴缓慢降低玻璃针。现在用移液器吸取一微升待注射药物，并将其滴加到一小块滤纸片上。将该滤纸片放置于颅骨上。通过旋转显微注射仪的轮子吸取药物，同时在显微镜下观察，确保液体进入玻璃针头。移除封口膜，并重置零坐标。

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定向脑深部结构与配送药品，病毒载体，或细胞移植Microinjections

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来源：Poland, R. et al. 利用啮齿类动物脑部微量注射研究动机行为的分子基础。 J. Vis. Exp.

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