Name: RhoC的GTP酶激活法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习使用pull down实验技术检测细胞内活性RhoC GTPase水平的方法。该方案可量化RhoC活性，为研究细胞信号转导和RhoC生物学功能提供可靠手段。

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美国国防部 W81XWH-05-1-0005、W81XWH-06-1-0495、W81XWH-08-1-0029 和 W81XWH-08-1-0356

1. 准备GST融合蛋白
<ol>
 <li> 制备含有 rhotekin Rho 结合域（RBD）N 端前 90 个氨基酸的 JM109 感受态细菌甘油菌株，该片段已亚克隆至 BamH1/EcoR1 位点的 pGEX3x 载体中。 
 
 为确保高效率，每次实验都必须执行以下步骤。根据我们的经验，新鲜制备的 GST-RBD 是获得稳定且准确的 GTP 酶活化检测结果的关键。</li>
 <li> 取约 50 μL 甘油菌（无需解冻）加入 50 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基中，37°C 摇床过夜培养。</li>
 <li> 按 1:10 比例转接到 500 mL LB-amp 培养基中，培养 1 小时。</li>
 <li> 加入 0.1 mM IPTG 诱导 GST 融合蛋白表达，持续 2 小时。</li>
 <li> 将菌液均匀分装至离心管中，使用 Sorval GSA3 转子在 4°C、5000 RPM 条件下离心 20 分钟。</li>
 <li> 用 10 mL 裂解缓冲液*重悬沉淀。 
 *细菌裂解缓冲液：20% 蔗糖，10% 甘油，50 mM Tris（pH 8.0），0.2 mM Na2S2O5，2 mM MgCl2，2 mM DTT，临用前新鲜添加 PMSF、苯甲酰胺、抑肽酶和亮抑酶肽。</li>
 <li> 超声处理 2–3 分钟（具体时间取决于超声仪型号；我们使用 Fischer Sonic Dismembranator Model 500，设置为档位 6，占空比 50%）。</li>
 <li> 使用 Sorvall SS34 转子在 4°C、10,000 rpm 条件下离心 20 分钟。此时可取少量上清进行 SDS-PAGE 分析，考马斯亮蓝染色后应可见约 46 kDa 处的蛋白条带。</li>
 <li> 弃去上清，加入 1 mL 50% 谷胱甘肽-Sepharose 4B 悬浮液。</li>
 <li> 4°C 旋转孵育 30 分钟，用裂解缓冲液洗涤 3 次。</li>
 <li> 用 GST-fish 缓冲液**将 GST-RBD/谷胱甘肽-Sepharose 微珠重悬为约 1 mL 的 50% 悬浮液。**GST-Fish 缓冲液：10% 甘油，50 mM Tris（pH 7.4），100 mM NaCl，1% NP-40，2 mM MgCl2，临用前新鲜添加 PMSF、苯甲酰胺、抑肽酶和亮抑酶肽。</li>
</ol>
2. GST融合蛋白下拉实验
<ol>
 <li> 每次实验使用 5-10 × 106 个细胞</li>
 <li> 用预冷的 PBS 洗涤细胞一次，将培养板置于冰上（我们使用装满冰的平底玻璃皿），并加入 0.5 mL GST-fish 缓冲液进行裂解。</li>
 <li> 冰上孵育 5 分钟，用橡胶刮棒或平头刮刀收集细胞，转移至微量离心管中，在 4°C 下以 20,000 r.p.m. 离心 5 分钟。</li>
 <li> 将上清液转移至新的微量离心管中。取 50 μL 用于测定总 Rho 蛋白量（即结合 GDP 和 GTP 的 Rho 总量）。</li>
 <li> 加入 0.5 mL GST-RBD/谷胱甘肽-Sepharose 珠子，在 4°C 下旋转孵育过夜。</li>
 <li> 用 GST-fish 缓冲液洗涤 6 次。</li>
 <li> 将珠子重悬于 40 μL 2× Laemmli 样品缓冲液中。 
 此时应测定步骤 2.4 中取样的总 Rho 蛋白浓度，并准备 30 μg 样品，与相应的激活样品一同上样电泳。</li>
 <li> 样品在 90°C 下煮沸 5 分钟，短暂离心后取上清液（避免珠子），上样并使用 12 孔 4–20% 梯度 SDS-PAGE 凝胶进行电泳。</li>
 <li> 电泳电压不超过 150 伏，使用 Towbin 缓冲液并以恒定功率 100 W 将蛋白转移至膜上。</li>
 <li> 用 5% 脱脂牛奶/TBST 溶液封闭膜，然后用 RhoC 特异性抗体进行杂交检测。</li>
</ol>

3. 代表性结果
理想结果应在约 22 kDa 处出现单一条带。结果不佳时会出现多条条带或高背景信号，这表明可能存在蛋白质降解、样品洗涤不充分或使用了陈旧的 GST-RBD。

<img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="RhoC-GTP 蛋白表达分析；Western 印迹显示无表达至高表达条带；肌动蛋白对照。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 三种表达不同水平 RhoC GTPase 的独立细胞系用于展示 RhoC 活性形式和总蛋白的低表达、高表达或无表达情况。随后将印迹膜剥离并用针对持家基因肌动蛋白（actin）的抗体重新杂交，作为总 RhoC 蛋白的上样对照。
<img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="RhoC GTPase 激活印迹；蛋白质分析、电泳结果、GTPase 信号通路研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 多重条带或高背景信号可能源于蛋白质降解、样品洗涤不充分或使用了陈旧的 GST-RBD。

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

该实验流程中最关键的步骤是新鲜GST-RBD的制备。未能充分重视此步骤是实验失败的主要原因。从GST-RBD的制备（1.2）到与细胞裂解液的过夜孵育（2.5），所有步骤应在同一天内完成。另一个关键步骤是确保有足够的细胞用于制备细胞裂解液。这一点在检测RhoC GTP酶时尤为重要，因为RhoC在细胞中的表达水平通常较低。

<table><tbody><tr><td>谷胱甘肽-Sepharose 4B 微珠</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Criterion 4-20% Tris-HCl 凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc gtp酶激活实验

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase 与 RhoA GTPase 具有 91% 的同源性。由于 RhoA GTPase 在细胞中广泛存在，目前已开发出多种针对 RhoA GTPase 的试剂和技术。然而，RhoC GTPase 在转移性癌细胞中的表达水平相对较低，因此针对 RhoC 的特异性试剂较少。我们已对 Rho 活化检测方法进行了改进，以用于检测 RhoC GTPase。该技术利用 GST-Rho 结合结构域融合蛋白来沉淀活化的 RhoC GTPase。此外，我们可在实验开始时收集总蛋白，以测定细胞中总 RhoC GTPase（结合 GTP 和 GDP 的形式）的水平。这使得能够确定细胞中活化态与总 RhoC GTPase 的比例。尽管已有多个该实验的商业化版本，但这些商业试剂盒主要针对 RhoA GTPase 优化，通常对 RhoC GTPase 的检测效果不佳。因此，我们对实验的部分步骤进行了优化，并开发了 RhoC 特异性抗体。

本方案利用下拉实验测定细胞内活性 RhoC GTPase 的水平。

RhoC GTP酶激活实验

RhoC GTPase 与 RhoA GTPase 具有 91% 的同源性。由于 RhoA GTPase 在细胞中广泛存在，已开发出大量针对 RhoA GTPase 的试剂和技术。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

RhoC的GTP酶激活法

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