Name: 三层次的静电，以模仿母语动脉结构采用聚己内酯，弹性和胶原的初步研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-04T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 了解静电纺丝技术制备三层血管移植物的方法，使用聚己内酯、弹性蛋白和胶原模拟天然动脉壁结构。该研究通过调控各层材料配比优化力学性能，为组织工程血管构建提供有效策略。

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我们感谢美国心脏协会中大西洋分会（0555407U，GLB）提供的资金支持。

<ol>
	<li>在进行静电纺丝之前，必须使用乙酸基方法从6个月大的牛皮真皮中提取胶原蛋白。提取后的胶原蛋白再通过一系列溶解、沉淀和透析步骤进行纯化。胶原蛋白经冷冻干燥后，即可开始静电纺丝过程。</li>
	<li>称取三种材料：聚己内酯（PCL）、弹性蛋白（ELAS）和胶原蛋白（COL）。这些材料将分别溶解于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFP, TCI America）中，浓度分别为100 mg/ml、200 mg/ml和70 mg/ml。</li>
	<li>将上述材料按体积比混合于五个不同的闪烁瓶中，比例分别为98-2-0 PCL-ELAS-COL（内膜层）、45-45-10、55-35-10和65-25-10 PCL-ELAS-COL（中膜层），以及70-0-30 PCL-ELAS-COL（外膜层）。</li>
	<li>为进行单轴拉伸测试和各层独立顺应性测试，每种材料均单独进行静电纺丝；而用于爆破压力、缝线保留力和顺应性测试的多层血管移植物则采用3:1的结构进行静电纺丝。单轴拉伸测试用支架为平面矩形（2.5 cm宽 × 10.2 cm长 × 0.3 cm厚），因为用于静电纺丝单层及多层移植物的2 mm直径心轴过小，无法冲裁测试样品。</li>
	<li>无论是单层还是多层静电纺丝，均将聚合物溶液装入带有18号钝头针头的3 ml塑料Becton Dickinson注射器中，并置于设定流速的注射泵上。单层静电纺丝的流速设定为4 ml/hr，而多层静电纺丝的流速则根据过渡阶段和各层不同而调整。具体流速与体积如下：内膜层以4 ml/hr的流速纺丝0.5 ml，随后进入过渡阶段，内膜与中膜注射器同时工作，各以2 ml/hr流速共纺0.2 ml。之后关闭内膜注射器，中膜层以4 ml/hr流速继续纺丝0.6 ml，再进入中膜与外膜之间的过渡阶段，两注射器各以2 ml/hr流速共纺0.2 ml聚合物溶液。最后停止中膜层，外膜层以4 ml/hr流速纺丝0.4 ml。</li>
	<li>所有样品在测试前均在50 mM EDC中交联18小时1。</li>
	<li>单轴拉伸测试在PBS中水化24小时后的一片静电纺丝材料上取六个样品进行。“狗骨”形样品由静电纺丝膜冲裁获得，并在MTS Bionix 200测试系统上进行测试，配备100 N载荷传感器，拉伸速率为10.0 mm/min。使用TestWorks 4.0版本软件计算最大应力、模量和断裂应变。</li>
	<li>缝线保留力测试在六种不同静电纺丝移植物中各取一段内径为2 mm的管状样本上进行，样本在37°C PBS中浸泡24小时后，使用MTS Bionix 200测试系统（MTS Systems Corp.）和50 N载荷传感器，以150.0 mm/min的拉伸速率，按照美国国家标准协会规定的“直线穿过”程序进行测试2。使用5-0商用PDS II紫色单丝缝线，在距样本末端2 mm处穿入，并持续拉伸直至缝线完全穿过移植物。使用TestWorks 4.0版本软件记录峰值载荷，单位为克力（grams-force）。</li>
	<li>爆破强度测试在六种不同静电纺丝移植物中各取一个样本进行。长度为2–3 cm的爆破测试管在PBS中水化后，套在设备连接的直径1.5 mm乳头状接头上，并用2-0丝线固定。向系统内通入空气，以5 mmHg/s的速度增加压力，直至管道破裂。结果以管道破裂时的压力（mmHg）表示。</li>
	<li>动态顺应性测试在六种不同静电纺丝移植物中各取一段内径为2 mm、长度为3 cm的管状移植物上进行，测试条件模拟生理环境。单层及多层管状结构均在相同条件下进行静电纺丝和测试。样品在Tissue Growth Technologies开发的智能组织工程机械刺激（ITEMS）生物反应器中进行测试，反应器内充满37°C的PBS。生物反应器向移植物内部施加1 Hz的周期性压力变化，研究三种不同的压力水平：90/50、120/80和150/110 mmHg（收缩压/舒张压）2, 3。</li>
</ol>
代表性结果
如果静电纺丝操作步骤正确执行，最终产物应为一根柔软、无缝的管状物，各层之间无初始分层迹象。当进行单轴拉伸试验、爆破强度试验、缝线保留力试验和顺应性试验时，结果应表明：随着中层刚度增加且弹性蛋白含量减少，相应的力学性能将显示出管状物变得更刚硬。

<ol><li>McClure, M. J., Sell, S. A., Barnes, C. P., Bowen, W. C., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+Electrospun+Polydioxanone-Soluble+Elastin+Blends%3A+Material+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Engineered+Fibers+and+Fabrics%22%5BJournal%5D)">Cross-linking Electrospun Polydioxanone-Soluble Elastin Blends: Material Characterization.</a> Journal of Engineered Fibers and Fabrics. 3, 1-10 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cardiovascular+implants+-+Vascular+graft+protheses%22">Cardiovascular implants - Vascular graft protheses</a>. VP20, AAMI Press. Bethesda, MD. (1994).</li>
<li>McClure, M. J., Sell, S. A., Simpson, D. G., Walpoth, B. H., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-layered+electrospun+matrix+to+mimic+native+arterial+architecture+using+polycaprolactone%2C+elastin%2C+and+collagen%3A+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">A three-layered electrospun matrix to mimic native arterial architecture using polycaprolactone, elastin, and collagen: A preliminary study.</a> Acta Biomater. , (2010).</li>
</ol>

多位作者就本论文中所述技术拥有待批准的美国及国际专利，且该技术已授权给 Organogenesis, Inc. 公司。

本研究最关键的步骤是静电纺丝过程。使用3-1输入-输出喷嘴时，可能会发生电弧放电和电荷损失。一旦发生这种情况，与正在纺丝的聚合物相关的电压将下降，导致纤维熔融粘连、呈现“湿润”状态，并在三层结构之间产生分层现象。因此，保持稳定的电势对于获得理想的多层管状结构至关重要。
顺应性不匹配是小直径血管移植物闭塞的主要原因之一。开发多层结构的血管移植物能够定制移植物的特性，使其更接近天然动脉的生物力学性能和组织结构。随着多层血管移植物制备工艺的逐步推进，本实验室将进一步探究其潜在局限性，包括支架在降解过程中可能发生的层间剥离，以及孔径大小是否足以支持细胞浸润。为验证上述问题，将同时对无细胞和细胞化移植物进行测试 体外 将在静态和动态培养条件下进行降解研究。这些测试将确定支架的迁移能力及其在生理条件下的有效降解情况。

<table><tbody><tr><td>聚己内酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>弹性蛋白</td><td>Elastin Products Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 L Avanti J-HC 离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3 六氟-2-丙醇</td><td>TCI America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 ml Becton Dickinson 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CZE1000R 机架式电源</td><td>Spellman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压注射泵</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % 乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageTool 3.0 软件</td><td>由 UTHSCSA 提供的共享软件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTS Bionix 200 材料测试系统</td><td>MTS Systems Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TestWorks 版本 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通过机械刺激实现智能组织工程（ITEMS）生物反应器</td><td>Tissue Growth Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

三层层电纺丝技术模拟天然动脉结构：基于聚己内酯、弹性蛋白和胶原蛋白的初步研究

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

在天然动脉中，胶原蛋白和弹性蛋白发挥着重要作用，可提供机械支撑，防止血管破裂，并在脉动变形下促进恢复。本研究旨在通过制备一种多层电纺管状支架来模拟天然动脉的结构，该支架由聚己内酯（PCL）构成，并添加弹性蛋白和胶原蛋白，其组成为PCL-ELAS-COL 45-45-10、55-35-10和65-25-10三种混合比例，以展示出接近天然动脉组织的力学性能，同时保持有利于组织再生的特性。对整体移植物及各单层结构进行了单轴拉伸测试、动态顺应性、缝线保留力和爆破强度分析。顺应性结果表明，中间层（中膜层）的改变会影响移植物的整体行为，整体移植物的顺应性值范围为0.8 - 2.8 % / 100 mmHg，而单轴拉伸结果显示平均模量范围为2.0 - 11.8 MPa。模量和顺应性数据均处于天然动脉的数值范围内。通过数学建模分析了各层刚度变化对整体周向管壁应力的影响，并以此作为设计辅助工具，以获得最佳的材料力学组合。总体而言，结果表明可通过调节各层特性来设计出模拟三层结构的血管移植物。

本研究旨在模拟动脉壁天然的三层结构。为实现这一目标，采用静电纺丝技术，使用3-1（输入-输出）喷嘴，以及聚己内酯、弹性蛋白和胶原蛋白的混合物。

在整个天然血管中，胶原蛋白和弹性蛋白发挥着重要作用，可提供机械支撑，防止血管破裂，并促进修复……

以下实验的总体目标是观察不同层材料特性的变化如何影响移植物的整体力学性能。通过制备天然和合成聚合物溶液以提供最佳的电纺参数来实现这一目标。第二步，应将溶液按特定比例混合，从而实现材料特性的预期改变。接下来将溶液电纺到圆柱形芯模上，以制备具有不同力学性能的多层结构。获得的结果显示，基于顺应性、爆破强度、缝合保持力、单轴拉伸测试以及数学分析，材料的力学性能发生了变化。大家好，我叫Michael McClure。今天我将向您介绍三层结构的电纺海绵状血管移植物。与单层血管移植物等其他技术相比，本技术的主要优势在于我们能够精确调控各层材料的特性，从而影响整体的电纺材料性能。在进行电纺之前，采用乙酸为基础的方法从六个月大的牛皮质中提取胶原蛋白。随后通过一系列溶解、沉淀和透析步骤对提取的胶原蛋白进行纯化。为进行电纺丝工艺，需收集至少500毫克冻干胶原蛋白。接下来，使用一个20毫升的闪烁瓶，通过称取150毫克单体颗粒并溶解于50毫升1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中，配制浓度为100毫克/毫升的聚己内酯溶液。采用相同方法，配制7毫升浓度为200毫克/毫升的弹性蛋白溶液和7毫克/毫升的胶原蛋白溶液。然后使用五个闪烁瓶，在每个瓶中分别按以下体积比混合共计5毫升的PCL-弹性蛋白-胶原蛋白溶液：98:2:0（PCL:弹性蛋白:胶原蛋白），代表动脉内膜；45:45:10、55:35:10和65:25:10（PCL:弹性蛋白:胶原蛋白），代表动脉中膜；以及70:0:30（PCL:弹性蛋白:胶原蛋白），代表动脉外膜。现在使用一个3毫升、18号钝头针头，将3毫升溶液装入注射泵中。针对每种PCL-弹性蛋白-胶原溶液的特定材料特性，设定分配速率为每小时4毫升，总体积为3毫升。这些溶液将通过静电纺丝技术纺至矩形芯模上，以构建由聚己内酯-弹性蛋白-胶原聚合物溶液组成的多层血管移植物。静电纺丝速率将根据过渡层和各层的纺丝需求进行调整：内膜层采用每小时四毫升的流速，纺丝体积为0.5毫升；随后进入过渡阶段，同时使用内膜和中膜注射器，各以0.2毫升体积、每小时两毫升的纺 丝速率进行静电纺丝。接下来，关闭内膜注射器，以每小时四毫升的流速对中膜层继续静电纺丝0.6毫升。随后，在介质和Adventis注射器之间以每小时2毫升的速度各注入0.2毫升聚合物溶液进行过渡。最后，关闭介质注射器，继续以每小时4毫升的速度对Adventis进行0.4毫升的电纺丝。电纺丝完成后，对每个样品使用50毫摩尔的EDC，并在进一步测试前留出18小时进行交联。为了测试电纺材料的单轴拉伸参数，首先将电纺膜置于培养皿中，用15毫升的1倍PBS溶液水合24小时。然后使用标距长度为7.5毫米、最窄处宽度为2.5毫米的狗骨形冲模，从电纺膜上冲出六个样品。该形状可确保材料在最窄处发生断裂。接下来，使用 MTS Bionics 200 测试系统，配备 100 N 负荷传感器和 10 毫米/分钟的拉伸速率，对电极 BUN 样品进行测试。使用测试工作软件计算每种独立材料产品的峰值应力、模量和断裂时的应变。为测试多层移植物的缝线保留性能，收集六个直径为 2 毫米、长度为 3 毫米的管状电海绵试样，并将试样置于培养皿中，用 1 倍 PBS 在 37 摄氏度的培养箱中浸泡 24 小时。然后使用50 N的负荷传感器和150毫米/分钟的拉伸速率。使用MTX仿生200系统测试缝线保持力时，放置五零规格的市售PDs，两根紫色单丝线。使用游标卡尺测量，在样品末端2毫米处缝合，并持续拉伸直至缝线穿过移植物，利用TestWorks软件记录峰值载荷，单位为克力（gram's force）。版本四：为测试电纺移植物的爆破强度，另取六根直径为2毫米、长度为2至3厘米的电纺管状样品，在37摄氏度条件下于磷酸盐缓冲液（PBS）中水化24小时。水化后，将管状物套在连接于测试装置的直径为1.5毫米的乳头状接头上，用2-0丝线在移植物与接头末端打外科结固定。随后向爆破测试系统中注入空气，以每秒5毫米汞柱（mmHg）的速率增加压力，直至管状物破裂。以毫米汞柱（mmHg）为单位记录管道破裂时的压力，收集爆破强度数据。最后，通过获取六段直径为2毫米、长度为3厘米的管状移植物（分别取自六种不同的静电纺丝移植物）来评估动态顺应性。将样品在PBS中水化24小时。在37摄氏度条件下，将移植物套在定制的直径为1.5毫米的乳头状突起上，使用2-0丝线缝合，并打外科结固定。将移植物置于由Tissue Growth Technologies公司开发的智能组织工程力学刺激生物反应器中。将500毫升37摄氏度的PBS加入生物反应器中。设置生物反应器对移植物内部施加1赫兹的周期性压力变化，并测试三种不同的压力水平：舒张压/收缩压分别为90/50、120/80和150/110毫米汞柱。当电纺丝程序正确执行时，最终产物应为一个柔软且无缝的管状结构，如图所示，各层之间无脱氨的初始迹象。此处展示了一个分层的管状结构用于对比。该图像提供了关于含有特定PCL-弹性蛋白-胶原混合物的内膜、中膜和外膜各层在UNI轴向拉伸试验中的峰值应力（周向）以及断裂应变的测试数值。趋势显示，随着PCL含量的增加，峰值应力和周向模量均有所提高，而断裂应变则下降。缝线保留力结果在此一并展示，其中E-P-T-F-E表现出最高的缝线保留力，而65:25:10组分最接近以虚线表示的自体静脉标准；此外，还对非活性猪股动脉以及E-P-T-F-E进行了对比测试。如图所示，爆破压力表明，55比35比10以及65比25比10的材料具有最高的爆破压力，这与美国国家标准协会（American National Standards Institute）对所有拟上市血管移植物所要求的1 600毫米汞柱相当。最后，通过内部雷达在三种不同平均动脉压下进行的顺应性测试表明，仅在中层增加PCL含量即可导致在所有三种生理压力条件下顺应性逐渐降低。本研究最关键的环节是立法流程。当采用三比一的输入输出时，喷嘴处可能会出现压力损失。若发生这种情况，与当前正在进行电纺的聚合物相关的鼓胀也可能减小。这可能导致纤维焊接、湿润以及三层之间的脱层。因此，在电纺三侧血管移植物时，稳定的电势至关重要。

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三层次的静电，以模仿母语动脉结构采用聚己内酯，弹性和胶原的初步研究

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动物模型是评估组织工程移植物的重要工具。本文介绍了制备用于前交叉韧带组织工程的静电纺可生物降解聚合物移植物的实验方案，以及在大鼠模型中进行移植手术的操作流程。...

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通过静电纺丝或电喷雾技术，将可生物降解聚合物与具有相似组成的低表面能聚合物共混，制备出二维和三维超疏水聚合物材料。...

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本方案提供了通过熔体静电纺丝在直接书写模式下制备支架的全面指南。我们系统地概述了该过程，并定义了实现目标支架结构的适当参数设置。...

用于组织工程应用的可调控形貌三维聚(ε-己内酯)支架的熔融电纺写入制备

在此，我们介绍一种改良的静电纺丝方法，用于制备具有粗纤维和大孔结构的PCL血管移植物，并描述一种评估其性能的实验方案 体内...

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该方法为在三维（3D）支架（例如心脏瓣膜瓣叶）中构建仿生纤维结构提供了一种创新途径。采用3D打印的导电几何结构来确定形状和尺寸。每一层的纤维取向和特性均可独立调节。一个实验设置中可同时制备多个样品。...

结合3D打印与静电纺丝技术制造仿生心脏瓣膜瓣叶

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

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