Name: 用于测量的活性测定大肠埃希氏菌诱导赖氨酸Decarboxyase (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学习使用比色法测定大肠杆菌诱导型赖氨酸脱羧酶活性。该方法通过甲苯萃取分离产物并在340纳米处测量吸光度，为研究细菌代谢途径中的酶动力学提供可靠手段。

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我们感谢美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的迈克尔·卡谢尔博士（Dr. Michael Cashel）向我们提供细菌菌株、质粒及必要的实验方案。我们感谢多伦多大学生物化学系的约翰·格洛弗博士（Dr. John Glover）提供SpectraMax酶标仪的使用。UK获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）研究生奖学金、加拿大卫生研究院疾病相关膜蛋白结构生物学战略培训项目以及多伦多大学开放博士后奖学金的资助。本研究工作得到了加拿大卫生研究院（MOP-67210）向WAH提供的基金资助。

1）试剂与设备
<ol>
 <li>首先，配制以下三种溶液：1 mL 溶液A，由8 mM L-赖氨酸、100 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸钠（MES）pH 6.5、0.2 mM 核苷酸（核苷酸为二磷酸鸟苷（GDP）、三磷酸鸟苷（GTP）、鸟苷-5'-二磷酸-3'-二磷酸（ppGpp）或鸟苷-5'-三磷酸-3'-二磷酸（pppGpp）中的一种）、0.1 mM 5'-磷酸吡哆醛（PLP）和1 mM β-巯基乙醇（β-ME）组成；1 mL 溶液B，由100 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸钠（MES）pH 6.5、0.1 mM PLP、1 mM β-ME 和 50 nM LdcI 组成。LdcI 的纯化方法见 Snider 的描述 等.6 和 Kanjee 等. 14. 
 1 mL 溶液C，该溶液与溶液B相同，但不含LdcI。</li>
 <li>配制 100 mL 终止液，其中含 1 M 碳酸钠（10.6 g/100 mL），并分装 50 μL 使用多通道移液器向96孔聚苯乙烯板的每个孔中加入 30 μL 向孔板中加入水，然后盖上盖子。注意，所加水的体积与酶反应过程中提取的样品体积之和必须相等 50 μL。在这种情况下， 20 μL 将移除酶反应样品。</li>
 <li>通过稀释配制 5 mL 浓度为 10 mM 的 TNBS 溶液 294 μL 5% (w/v) TNBS 储存液 4706 μL 水，用铝箔纸包裹并置于冰上保存。</li>
 <li>将 Eppendorf ThermoStat Plus 平衡至 37°CThermoStat Plus 具有 6 列共 24 个孔。示意图见图 2。标记 1.5 mL Eppendorf 管，标明将要测试的核苷酸种类（每列一个）：GTP（A 列）、GDP（B 列）、ppGpp（C 列）、pppGpp（D 列）、无核苷酸（E 列）和蛋白样品（F 列）。</li>
 <li>架起数个盒子 200 μL 移除部分枪头，使每间隔一行移除一行，最终保留四行枪头。此步骤对于在酶活性检测中将多通道移液器与ThermoStat Plus加热模块配合使用是必要的。</li>
 <li>将数字加热块（VWR）平衡至 42°C.</li>
 <li>将一个96孔2.0 mL聚丙烯板置于冰上冷却。</li>
</ol>
2) LdcI 检测
<ol>
 <li>使用适当的核苷酸，将溶液A各50 μL分装至Eppendorf ThermoStat的五个列中的1.5 mL Eppendorf管中。</li>
 <li>向F列中的三个管中各加入330 μL溶液B，并向F列最后一个管中加入330 μL溶液C（无蛋白对照）。</li>
 <li>将溶液在37°C下平衡5分钟。提示：5分钟后，剪掉加热块中央各管的管盖，以避免其干扰下一步使用的多通道移液器。</li>
 <li>使用5–50 μL VWR多通道移液器，将F列各管中的50 μL转移至A–E列的每个管中。从第一个管混合开始时即启动计时器。</li>
 <li>在2、4和6分钟时，使用多通道移液器取出20 μL样品，加入终止液中。</li>
 <li>注意：终止液中的样品可用塑料膜覆盖，并在-20°C下冷冻以备后续处理。在与TNBS反应前，应将板在室温下解冻。</li>
</ol>
3）TNBS 反应与显色
<ol>
 <li>使用多通道移液器向终止液中加入 50 μL 的 10 mM TNBS 溶液，然后在 42°C 下孵育 6 分钟。随着 TNBS 与赖氨酸和尸胺发生反应，溶液将变为深黄色/橙色。</li>
 <li>6 分钟后，将酶标板置于冰上冷却以减缓反应速度。</li>
 <li>使用 VWR 20–200 μL 多通道移液器吸取 100 μL 样品，转移至预先在冰上冷却的 2 mL 深孔板中。将装有冰的冰桶转移至通风橱内。</li>
 <li>使用 HandyStep（Brand）多排移液器和 12.5 mL 移液器吸头（Plastibrand），向每个孔中加入 500 μL 甲苯。</li>
 <li>用无尘纸擦去多余的甲苯，并用包装胶带密封酶标板。确保用力按压以形成良好密封。用平盖盖住 96 孔板，剧烈振荡 1 分钟 30 秒。</li>
 <li>让溶液静置 5 分钟。此时 TNP-尸胺位于上层甲苯相中，而 TNP-赖氨酸仍溶于水相（见图 1）。</li>
 <li>使用 20–200 μL 多通道移液器吸取 200 μL 甲苯层至用于检测的 96 孔板中。注意：务必检查所取每份样品是否澄清，避免混入底层水相。注意：使用带滤芯吸头，以防止甲苯对多通道移液器造成损害。</li>
 <li>在 SpectraMax 340 酶标仪中于 340 nm 处读取吸光度。</li>
 <li>清洗石英板时，先用水冲洗去除甲苯，然后将石英板放入通风橱内的大玻璃托盘中。倒入 100 mL 7:3 的 70%（v/v）硝酸与 95%（v/v）乙醇混合液，并用另一玻璃托盘盖住石英板。警告：该反应剧烈放热，有时可能发生爆炸，请穿戴适当的防护装备，并确保通风橱窗高度设置在最低 6 英寸位置。待冷却后，用水冲洗去除硝酸，再用 95% 乙醇清洗。</li>
</ol>
4）代表性结果
1）尸胺标准曲线（图3） 
 实验操作如前所述，但不添加L-赖氨酸或LdcI，而是使用不同浓度的尸胺，以经验性确定实验的线性范围。该实验的线性范围可达OD340为0.25，相当于约22 nmol的尸胺（图3）。
2）LdcI 的活性（图 4） 
 单独 LdcI 的活性在 pH 6.5 条件下测定为 153.5 (± 18.1) nmoles 鲸尸胺 min⁻¹ μg LdcI⁻¹。LdcI 的活性在存在 100 μM GTP 或 GDP 时不受影响，但在存在 pppGpp 和 ppGpp 时受到强烈抑制（>10 倍）（图 4）。
<img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig1.jpg" alt="化学反应示意图：L-赖氨酸与TNBS在LdcI酶作用下合成TNP衍生物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. LdcI反应的示意图。 图示L-赖氨酸脱羧生成CO2和尸胺的反应，以及在高pH条件下与TNBS进一步反应生成N,N'-双三硝基苯基尸胺（TNP-尸胺）和N,N'-双三硝基苯基赖氨酸（TNP-赖氨酸）。依据Phan等人的研究11
<img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig2.jpg" alt="使用96孔板进行TNBS反应显色的微孔板孵育与检测流程示意图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. Eppendorf恒温仪的设置。 图示为24孔Eppendorf ThermoStat中样品的排布，并附有检测各步骤的说明（以粗体标出）。箭头表示根据实验方案转移反应液的过程。同时标出了将反应液转移至96孔板中终止液的操作。
<img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig3.jpg" alt="色谱分析图，显示吸光度与尸胺（nmol）数据的关系，呈线性趋势。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3. 尸胺标准曲线。 图中显示了在340 nm处的吸光度与尸胺（nmol）之间的关系。误差线代表至少三次独立测量的标准偏差。图中还显示了最佳拟合直线，其R²为0.996。
<img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig4.jpg" alt="在含有 GTP、GDP、ppGpp、pppGpp 及无核苷酸条件下，尸胺生成速率的柱状图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
 图 4. LdcI 酶活性测定结果。 图示 LdcI 活性速率（单位：nmol 尸胺 min⁻¹ μg⁻¹ LdcI）在 100 μM GTP、GDP、pppGpp、ppGpp 存在下以及无核苷酸条件下的变化。严谨反应核苷酸 (p)ppGpp 能够显著抑制 LdcI 的活性。误差线代表至少六次独立测量的标准偏差。

<ol><li>Gale, E. F., Epps, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+pH+of+the+medium+during+growth+on+the+enzymic+activities+of+bacteria+%28Escherichia+coli+and+Micrococcus+lysodeikticus%29+and+the+biological+significance+of+the+changes+produced%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced.</a> Biochem J. 36, 600-618 (1942).</li>
<li>Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+acid+resistance%3A+tales+of+an+amateur+acidophile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).</li>
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<li>Iyer, R., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine-agmatine+antiporter+in+extreme+acid+resistance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).</li>
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<li>Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+the+Bacterial+Acid+Stress+and+Stringent+Responses+Revealed+by+the+Structure+of+the+Inducible+Lysine+Decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase.</a> EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在赖氨酸脱羧酶检测中，TNBS 与 L-赖氨酸和尸胺中的伯胺反应，生成 TNP-赖氨酸和 TNP-尸胺加合物（图1）。由于 TNP-赖氨酸含有羧基，该加合物可溶于水；而 TNP-尸胺缺乏羧基，因此能够分配进入甲苯相11。此类检测方法也可更广泛地应用于其他类型的氨基酸反应，特别是反应过程中发生羧基丢失的情况。例如，可诱导的鸟氨酸脱羧酶 SpeF 催化 L-鸟氨酸脱羧生成多胺腐胺7，以及可诱导的精氨酸脱羧酶 AdiA 催化 L-精氨酸脱羧生成多胺氨丁胺4，均属于此类反应。
本文所述的LdcI检测方法为体外测定纯化蛋白活性提供了一种相对较快的方法。该检测方法的主要优势包括：
i) 每次实验使用多个重复样本可提高每次测量的精确度；
ii) 该检测可在多种缓冲条件（不同pH值、盐浓度、还原剂等）下进行，无需修改实验方案；
iii) 该检测方法可进行修改以...

<table><tbody><tr><td>2,4,6-三硝基苯磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2297</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mM 吡哆醛 5&amp;rsquo;-磷酸盐 (PLP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9255</td><td></td></tr><tr><td>尸胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D22606</td><td></td></tr><tr><td>96孔聚苯乙烯板</td><td>Sarstedt Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔石英板</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 数字加热块</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoStat Plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 96孔聚丙烯板</td><td>Axygen Scientific</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Handy Step 重复移液器</td><td>Brand GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12.5 mL 重复移液器吸头</td><td>Brand GmbH</td><td>702378</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 340PC 酶标仪</td><td>SpectraMax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于测量活性的检测方法 大肠杆菌 可诱导赖氨酸脱羧酶

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli 是一种肠道细菌，能够在较宽的 pH 范围（pH 5 - 9）1内生长，且令人惊讶的是，它还能在极端酸性胁迫下存活，包括通过哺乳动物胃部时，其中 pH 可低至 pH 1 - 22。为适应如此广泛的酸性 pH 环境，E. coli 拥有四种可诱导的氨基酸脱羧酶，这些酶以依赖质子的方式对其底物氨基酸进行脱羧，从而提高细胞内 pH。这些脱羧酶包括谷氨酸脱羧酶 GadA 和 GadB3、精氨酸脱羧酶 AdiA4、赖氨酸脱羧酶 LdcI5, 6 以及鸟氨酸脱羧酶 SpeF7。所有这些酶均以磷酸吡哆醛-5'-磷酸（PLP）作为辅因子8，并与内膜上的底物-产物反向转运蛋白协同作用，将脱羧产物转运至胞外，同时交换新的底物进入细胞2。对于 LdcI 而言，其赖氨酸-尸胺反向转运蛋白为 CadB。近期，我们解析了 LdcI 的 X 射线晶体结构，分辨率达到 2.0 Å，并发现一种新型小分子结合于 LdcI —— 严格反应调控因子鸟苷-5'-二磷酸-3'-二磷酸（ppGpp）14。严格反应通常发生在指数生长期的细胞遭遇营养缺乏或其他多种胁迫时9。此时，细胞会生成 ppGpp，进而触发信号级联反应，最终促使细胞由指数生长期转入静止期10。我们已证实 ppGpp 是 LdcI 的特异性抑制剂14。本文中，我们描述了一种赖氨酸脱羧酶活性检测方法，该方法经 Phan 等人开发的检测法改良而来11，用于测定 LdcI 的酶活性以及 pppGpp/ppGpp 对其活性的影响。LdcI 催化的脱羧反应可去除 L-赖氨酸的 α-羧基，生成二氧化碳和多胺类物质尸胺（1,5-二氨基戊烷）5。L-赖氨酸与尸胺可在高 pH 条件下与 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）反应，分别生成 N,N'-双三硝基苯基尸胺（TNP-尸胺）和 N,N′-双三硝基苯基赖氨酸（TNP-赖氨酸）11。TNP-尸胺可与 TNP-赖氨酸分离，因为前者可溶于甲苯等有机溶剂，而后者则不溶（见图1）。本检测方法的线性范围通过使用纯化的尸胺进行实验测定。

通过将底物L-赖氨酸和产物尸胺与2,4,6-三硝基苯磺酸反应生成在甲苯中溶解度不同的加合物，来监测可诱导赖氨酸脱羧酶的活性。

大肠杆菌是一种肠道细菌，能够在较宽的pH值范围（pH 5 - 9）内生长1，且令人惊讶的是，还能在极端……条件下存活

本实验的总体目标是利用比色法测定大肠杆菌可诱导赖氨酸脱羧酶的活性。首先，在EOR管中将底物L-赖氨酸与酶LDCI进行反应，然后在三个时间点分别取样至终止液中以终止反应。实验的第二步是将终止液中的样品与2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）反应；TNBS可与底物的伯胺基团发生反应，分别生成TMP-赖氨酸和TMP-尸胺产物。该实验步骤的第三步是通过将水不溶性的TMP尸胺萃取至甲苯中，从而分离水溶性的TMP赖氨酸。实验步骤的最后一步是测定甲苯相中TMP尸胺在340纳米处的吸光度。最终，可获得实验结果。CHO LDCI 活性受到严谨反应信号分子 P-P-G-P-P 和 P-P-P-G-P-P 存在的调控。大家好，我是来自多伦多大学生物化学系 Wali 博士实验室的 Hir。今天我们将向您展示一种测定大肠杆菌可诱导赖氨酸脱羧酶（LDCI）活性的实验方法。在我们的实验室中，该方法用于研究LDCI及肠道细菌酸应激反应通路的新调控因子的作用。现在，让我们开始吧。开始此实验步骤前，按照书面实验方案所述准备所有必要的溶液。接着将 EINOR 恒温仪 plus 预热至 37 摄氏度。该恒温仪 plus 配备一个具有 24 个孔的加热模块，孔位按六列排列。每列将用于检测一种特定的核苷酸，然后用相应的核苷酸标记24个0.5毫升离心管，并将标记好的试管放入加热模块中。此外，将若干盒200微升吸头摆放成架，使每一间隔行留空，从而形成共四行吸头。此布置对于在酶活性检测过程中使用多通道移液器配合恒温仪和加热模块是必要的。接下来，将数字加热模块预热至 42 摄氏度。取一个 96 孔 2.0 毫升聚丙烯板置于冰上冷却。最后，准备一个含有终止液的 96 孔板。使用VWR五通道5至50微升移液器和LDCI检测分装法，向样品中加入50微升终止液，随后加入30微升水。将50微升用适当核苷酸配制的溶液A加入对应试管中。接着，向加热块F列的三个试管中各加入330微升溶液B。最后，向F列最后一支试管中加入330微升无蛋白对照溶液C，在37摄氏度下平衡溶液5分钟。孵育结束后，剪掉加热块中央试管的管盖，以避免干扰多通道移液器的操作。然后使用5至50微升的DWR多通道移液器，在第一支试管混合后立即从F列各试管中吸取50微升溶液，分别转移至A列每支试管中。启动计时器。继续将50微升溶液从F列转移至B至E列。两分钟后，使用多通道移液器从每个样品中取出20微升，转移到文本中所述的96孔聚苯乙烯板中预先准备好的终止溶液中。在第一支试管混匀后四分钟和六分钟时重复此步骤。此时，含有终止液的样品可用塑料膜封好，并在与TNBS反应前于零下20摄氏度冷冻保存。将板置于室温下解冻后，使用多通道移液器向含有终止液的96孔聚苯乙烯板的每个孔中加入50微升10毫摩尔的TNBS溶液，在42摄氏度孵育六分钟。随着TMBS与赖氨酸和尸胺反应，溶液将

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生物学

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利用荧光生成型DNA酶检测细菌

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