Name: 在体内微循环在骨骼肌内重要的显微镜测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学习体内显微技术测量骨骼肌微循环，定量分析红细胞通量、流速及血浆流动。该方法支持长期观察，可与药理学干预结合，为神经科学和微循环研究提供连续监测手段。

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我们感谢 JW Lichtman 在肌肉体内观察方面的建议。

红细胞膜染色
<ol>
<li>从小鼠品系中采集经肝素抗凝处理的小鼠红细胞。</li>
<li>使用 PKH26 染料（551/567 nm；Red fluorescent cell linker kit，Sigma，美国）对小鼠红细胞进行染色。</li>
<li>将红细胞在 PBS 中洗涤后，与 2μM 的 PKH26 染料溶液在室温下孵育 5 分钟。通过加入预先在 65°C 下热灭活 1 小时的血浆终止反应，并继续孵育 1 分钟。</li>
<li>染色后的红细胞用 PBS 洗涤 5 次。</li>
</ol>
小鼠准备
<ol>
<li>本研究使用3至6月龄的雄性C57BL/10小鼠。通过腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。</li>
<li>随后，将小鼠插入20号聚乙烯导管进行气管插管，实施机械通气，并置于连接热电偶传感器和反馈温控系统的Kapton加热板上，维持体温在37°C。</li>
<li>剃除小鼠颈部腹侧毛发，暴露左右胸锁乳突肌。肌肉由不锈钢支架固定，并用无菌克氏任氏液进行灌流。</li>
</ol>
注射
<ol>
<li>将染色的红细胞在37°C下温育，并用Krebs Ringer液稀释。从阴茎静脉向小鼠注射50 µl染色红细胞（红细胞比容为12%）。</li>
</ol>
骨骼肌的活体显微观察
我们采用 Jeff W. Lichtman 的方法并进行了修改1:
<ol>
<li>将动物置于尼康Eclipse-800显微镜自制定制铁架上的加热垫上。使用浸水物镜进行活体荧光透射观察。在汞灯荧光照射下，观察经PKH26标记的红细胞在血管内的流动情况。根据红细胞流动方向和血管结构特征，识别出初级小动脉、次级小动脉、毛细血管和静脉。</li>
<li>安装增强型SIT相机（Hamamatsu Photonics，C2400，日本）和视频帧采集卡，以实时视频速率（每秒30帧）捕获低强度信号。图像以视频文件形式记录在DVD上。</li>
</ol>
肌肉刺激
<ol>
<li>使用外周神经刺激器（Innervator 252，Fisher &amp; Paykel Healthcare，新西兰）产生电脉冲，并通过镀层不锈钢探针传递至肌肉表面。负极探针端置于肌肉近端，正极探针端置于肌肉远端。以50 Hz频率给予5秒的强直刺激。电刺激未在接触区域附近引起直接的肌纤维损伤。</li>
</ol>
红细胞流速分析
<ol>
<li>通过帧捕获软件（Video Savant，美国）将录制的DVD视频图像转换为Video Savant图像文件。以调整后的速度回放视频图像，以便观察单个染色的红细胞。通过计数每分钟流经一段聚焦的小动脉的红细胞数量来测量红细胞流速。</li>
</ol>

<ol><li>Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neuromuscular+junctions+over+periods+of+several+months+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice.</a> J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).</li>
</ol>

所有与动物实验相关的程序均经麻省总医院研究动物护理小组委员会审查并批准。

重要的技术要点如下：（1）维持动物的生理状态（通气、灌注液的pH值、体温），（2）染色红细胞的注射体积，以及（3）观察条件（最佳物镜选择、荧光强度）。潜在的未来应用包括：（a）与药理生理学和/或分子生物学干预手段相结合，（b）对动脉/小动脉硬化及新生血管形成的长期观察。

<table><tbody><tr><td>PKH26 染料 </td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>551/567 nm；红色荧光细胞连接试剂盒</td></tr><tr><td>C57BL/10 小鼠 </td><td>动物</td><td></td><td></td><td>3 至 6 月龄雄性</td></tr><tr><td>戊巴比妥 </td><td></td><td></td><td></td><td>麻醉剂，50 mg/kg 体重，腹腔注射</td></tr></tbody></table>

活体显微镜下测量骨骼肌内微循环

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

背景：尽管已发明多种成像方式，体内微循环的调控因素及其详细生理机制仍未完全阐明。许多宏观血流参数反映的是血流速度，但在显微观察中，血流速度的变化与红细胞（RBC）流量之间并不呈线性关系。已有报道指出，在显微观察下，红细胞速度与红细胞流量之间、红细胞流量与血浆流体积之间存在不一致现象，且外周组织中的血流调节表现出空间和时间上的异质性。这些发现构成了利用活体显微镜对微循环调控进行更深入研究的科学依据。方法：我们改进了Jeff Lichtman用于活体显微观察小鼠胸锁乳突肌的方法。小鼠经麻醉、通气，并注射PKH26L荧光标记的红细胞，以便进行显微观察。结果与结论：通过宽场显微镜可清晰检测并区分荧光标记的红细胞。电刺激诱发的肌肉收缩引起红细胞流量增加。其他参数（包括红细胞流速和毛细血管密度）的定量分析亦可实现。小鼠对手术、注射标记红细胞、显微观察及电刺激均耐受良好。未观察到肌肉或血管损伤，表明本方法相对侵入性较小，适用于长期观察。

介绍了一种用于观察微循环的新颖且多功能的方法。该方法适用于长期观察，并可与药理生理学或分子生物学干预相结合。

背景：尽管已采用多种不同方法进行了研究，但体内微循环的调控因素及其详细生理机制仍未完全阐明。

大家好，我叫Aki，是哈佛医学院麻省总医院的一名研究学者。在这期视频期刊中，我将介绍一种新型的活体显微镜技术。利用该技术，我们能够对微分泌中的血流进行定量测量。本实验的目的是建立一个用于连续测量活体微分泌的系统。我们设计了该项目，旨在通过显微镜下观察活体动物肌肉中毛细血管及前部的血流情况。与传统的活体离子测量方法（如血液超声或氧张力检测）相比，该系统能够同时测量血流的多个参数，包括红细胞流量、肥胖流速以及血浆流速。对这些参数的测量将更详细地揭示微循环的变化。然后，我们采用该方法检测活体肌肉组织在生理刺激下血流的变化。与传统的活体显微技术相比，我们的方法更为简便且侵入性更小，从而可直接接触肌肉组织，并能够在小鼠肌肉上施加电生理刺激，以描述血流对肌肉收缩的详细响应。实验中通过戊巴比妥钠诱导全身麻醉。使用脱毛膏去除颈部毛发。插入气管插管。将插管连接至颈部内的机械呼吸机。暴露皮肤、胸锁乳突肌，将胸锁乳突肌组织块置于温度控制垫上。从小鼠获取血液，用PBS洗涤红细胞并用PKH26标记。室温孵育5分钟，用热灭活血浆淬灭染料，再用PBS洗涤红细胞。将染色的红细胞静脉注射到另一只同品系的小鼠体内，将电脉冲发生器的探针连接至肌肉，然后将肌肉置于显微镜载物台上。在荧光显微镜下观察并记录图像。观察结果显示，电脉冲发生器成功诱导了正常的生理收缩。为获得一致的数据，本实验中有以下几个重要的技术要点。首先，为了维持动物的正常生理状态，我们将小鼠连接至机械呼吸机，潮气量设为 60 µL，呼吸频率设为每分钟 60 次，以保持血气参数处于稳定的生理状态。动物的体温通过加热垫控制，并维持在 37 °C。其次，为了定量血流，我们计数了通过大写字母 E 注射后运行的染色红细胞。染色红细胞的体积保持一致，因此染色红细胞与未染色红细胞的比例应为0.1%至0.5%。通过该注射方法，在计数时根据实际计数结果以及染色与非ST染色红细胞群体的比例，可实现最佳的红细胞间分离效果。对于在显微镜下进行的活体观察，选择合适的物镜至关重要。应根据物镜的水浸入能力和工作距离来选择适当的物镜。此外，我们通过组合中性密度滤光片来降低荧光灯强度，以避免光照对肌肉组织产生意外影响。进一步的应用中，我们计划将该方法扩展用于研究微循环对各种药理学和分子生物学干预的反应。由于动物能够耐受该操作并良好存活，实验后我们能够在长期时间内对同一动物进行多次重复实验，从而测量血管扩张剂或血管收缩剂如何改变毛细血管和小动脉水平的血流动力学参数。例如，可以在同一只小鼠的单个血管中，在微分泌水平上追踪动脉硬化或血管生成的细微变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在体内微循环在骨骼肌内重要的显微镜测量

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活体显微镜下测量骨骼肌内微循环

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