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基于 siRNA 反向转染的体外基因沉默:一种在培养细胞中递送小干扰 RNA 以灭活靶基因表达的程序
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Transcript
用改进的最小必需培养基吸取 siRNA 进行移液以混合，并在室温下孵育 5 分钟。将转染试剂和改进的最低必需培养基添加到 siRNA 中，然后移液混合。在室温下孵育 20 分钟。然后，将转染混合物添加到胶原包被板的每个孔中。
用 DPBS 在 100 毫米培养皿中洗涤细胞两次。向细胞中加入 5X 胰蛋白酶，确保胰蛋白酶覆盖整个表面。等待 30 秒，然后小心地去除胰蛋白酶。将培养皿在 37 °C 下在培养箱中孵育 5 至 10 分钟。
然后，轻敲培养皿以分离细胞，避免细胞损伤。加入 10 毫升不含丙酮酸的 DMEM、25 mM 葡萄糖、10% FCS 和 1% 青霉素和链霉素，以中和胰蛋白酶。小心地上下移液培养基以分离细胞并使细胞悬液匀浆。
使用 Malassez 计数室或自动细胞计数器对细胞进行计数，并将细胞浓度调节至 6.25 x 105 个细胞/mL 培养基。接种 12 孔板每孔 800 μL 细胞悬液，或接种含有转染混合物的 24 孔板每孔 400 μL 细胞悬液。
将板在细胞培养箱中孵育，24 小时内不要打扰它们。第二天，小心地用不含丙酮酸的新鲜 DMEM、25 mM 葡萄糖、10% FCS 和 1% 青霉素和链霉素替换上清液，并将细胞放回培养箱中。
