双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

您好，我是罗切斯特大学AL帮助实验室的博士后研究员JA。我们将向您展示如何在新鲜冷冻的脑切片中进行原位杂交双酶消化，以在单细胞分辨率下同时检测两种mRNA转录本。该方法有助于回答神经科学领域中的相关问题，例如与脑环路的解剖学、功能、分子及神经化学组织相关的问题。

尽管该方法可为AV脑神经元中的基因凝集提供见解，但也适用于其他系统，如啮齿类动物以及多种神经组织。开始此操作时，用适量水将SDX G 50粉末与RNAs充分水合。

短暂混匀溶液，并在室温下静置 2 至 5 分钟。此步骤可在 Sedex G 50 沉淀后，将 SDX 磁珠与商用 Sedex 粉末中的葡萄糖分离。弃去上清液，最终洗涤后重复该过程 3 至 5 次，然后以 1:1 的缓冲液体积与磁珠体积比例将 SX G 50 溶液重悬于 TE 缓冲液中，并于 4°C 保存直至使用。

接下来，准备层析柱。将经高压灭菌的玻璃棉放入一个无菌的1毫升注射器中，并用活塞压实，使其在底部形成一层紧密的垫层。然后将该注射器置于一个15毫升离心管中。

使用配备 C 0 6 5 0 固定角度转子的 Beckman 离心机，在 1000 转/分钟的条件下离心 30 秒，用 Sedex G 50 溶液填充层析柱。离心后，每根层析柱中加入 200 µL 柱洗涤缓冲液，于 1000 转/分钟离心 2 分钟，进行洗涤。

同前。最后向每根柱中加入200微升柱封闭缓冲液，以每分钟1000转的速度离心2分钟。重复此步骤4至5次，以平衡层析柱。

将制备好的层析柱保存在4°C，直至RIBA探针标记完成并准备好进行纯化，用于此处展示的双荧光C2杂交（double fluorescence in C two hybridization）或DFISH实验。本实验中制备两种RNA探针，一种用洋地黄素苷（digoxigenin, DIG）标记，另一种用生物素（biotin）标记。首先配制Ribo探针标记反应液，并在37°C水浴中孵育2小时以启动探针标记反应。2小时孵育结束后，向每个标记反应体系中加入1微升浓度为20微克/微升的tRNA以及39微升层析柱封闭缓冲液。

然后通过向每个 EDEX G 50 柱中加入 50 µL 封闭缓冲液，并在 2000 ×g 下离心 3 分钟，以准备探针纯化。重复此步骤 2 至 3 次以平衡色谱柱。当色谱柱准备就绪后，在柱底部放置一个新的 EEND 收集管。

将探针溶液加入Sedex G 50柱中，以每分钟2000转的速度离心3分钟。为获得纯化的50微升Ribo探针溶液，需评估标记并纯化后的Ribo探针的质量和产量。在使用冷冻切片机进行杂交之前，将两到三张脑切片收集到带电荷的Super Frost Plus载玻片上。

切片厚度应为 10 至 12 微米。载玻片可于 -80 °C 保存至使用。将切片置于新配制的冷 3% 多聚甲醛溶液中孵育 5 分钟。

然后用 PBS 将切片短暂漂洗两次。接着将切片依次通过标准的酒精系列（70%、95% 和 100% 乙醇溶液）进行脱水，每种溶液中处理两分钟。脱水完成后，将切片置于新鲜配制的乙酰化溶液中孵育 10 分钟。

然后用2倍SSPE缓冲液将切片冲洗三次，并在乙酰化后再次按照上述标准酒精系列对切片进行脱水。现在开始用核糖探针进行杂交。向组织上加入适量的杂交溶液，用盖玻片覆盖载玻片，并将载玻片放入金属载玻片架中。

将切片架浸入设定为 65 摄氏度的矿物油浴中过夜。第二天，小心地将切片架从矿物油浴中取出，并用氯仿短暂冲洗以去除切片上的多余油渍。

将载玻片置于2倍SSPE溶液中5至10分钟，以去除盖玻片。去除盖玻片后，将载玻片转移至新的2倍SSPE溶液中，并在室温下孵育1小时。在此孵育步骤开始前，将含有50%甲酰胺的2倍SSPE溶液预热至与杂交步骤相同的温度。在1小时孵育结束时进行下一步操作。

将载玻片转移至预热的2倍SSPE溶液中，孵育1.5小时。在此孵育步骤开始时，将0.1倍SSPE溶液预热至与杂交步骤相同的温度。最后，将载玻片转移至预热的0.1倍SSPE溶液中，孵育30分钟，完成杂交后的洗涤步骤。

重复此洗涤步骤一次。脑切片现可进行杂交核糖探针的检测与显色：向TNT缓冲液中加入0.3%过氧化氢，将切片在此溶液中孵育10分钟。随后使用脱蜡笔（deco pen）将切片在TNT缓冲液中清洗三次，每次10分钟。

在含有脑切片的区域周围画一个圈。向每张载玻片上加入150微升TNB缓冲液，并将切片在此溶液中孵育30分钟。确保在此步骤中切片不会干燥。

接下来，每张切片加入 150 µL 含有过氧化物酶偶联抗 DIG 抗体的 TT NB 溶液，将切片置于湿盒中孵育 2 小时。2 小时孵育结束后，用 TNT 缓冲液洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。每次洗涤后，向每张切片加入 150 µL Alexa 594 偶联 T IDE 工作液，并将切片置于湿盒中孵育 1 小时。

一小时结束后，用TNT缓冲液洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。每次洗涤后，将切片在含0.3%过氧化氢的TNT缓冲液中孵育10至30分钟。过氧化氢溶液中的孵育时间取决于mRNA的丰度，应在进行D鱼实验前进行测试。

然后用TNT缓冲液将切片洗涤三次，每次10分钟。每张切片加入150 µL TMB缓冲液，并将切片置于湿盒中孵育30分钟。通过倾斜切片去除多余的TMB溶液。

加入150 µL含有辣根过氧化物酶偶联的二抗的TMB溶液，将切片置于湿盒中孵育2小时。然后用TNT缓冲液洗涤切片3次，每次10分钟。每次加入150 µL Alexa 488偶联的二抗工作液至切片，孵育1小时。

然后用TNT缓冲液洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。现在两种核糖探针均已通过抗体标记，将切片置于150微升的宿主溶液中孵育2分钟。随后用TNT缓冲液洗涤切片，每次5分钟，共洗涤三次，加入适合荧光检测的封片介质（如Vector Shield或Prolonged Antifa），盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。

这些代表性显微照片来自一项D鱼实验中的斑胸草雀脑切片，具体取自NCM区域，即鸣禽类中相当于哺乳动物听觉皮层的区域。脑切片使用两种探针进行杂交：一种是针对小白蛋白的生物素标记核糖探针，用于标记抑制性神经元的一个亚群；另一种是针对活动依赖性基因zinc的DIG标记核糖探针，该基因是声音刺激激活神经元的可靠标记物。两张图像的叠加显示了一群由听觉经验激活的抑制性神经元。

箭头指示仅用 par 的核糖探针标记的细胞。白蛋白箭头指示仅用锌代表性神经元 RIBA 探针标记的细胞。同时表达两种目标转录本的共表达细胞用星号标记。在进行此操作时，重要的是要记住保持实验台清洁，并使用无污染的溶液、塑料制品和玻璃器皿。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在新鲜冷冻的脑组织切片中以单细胞分辨率同时检测两种MA物种，以研究人脑中的基因共调控。感谢观看本视频，祝您的实验顺利成功。