Name: 双荧光原位杂交食脑切片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学习双荧光原位杂交技术，在脊椎动物脑组织薄片中同时检测两种转录本，实现单细胞分辨率。该方法适用于啮齿类等多种神经组织，助力研究大脑回路的解剖、功能与分子神经化学组织机制。

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本工作获得美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NIDCD）和施密特基金会资助，资助对象为RP。

本方案基于标准的放射性与非放射性方法开发并不断优化 原位 杂交方法，此前由我们及其他研究者开发，用于检测脑组织中的一种或两种转录本物种 1-7以下所述方案的总时长为2至3天，具体取决于最终使用者选择的程序中断次数。除核糖探针杂交步骤及杂交后洗涤步骤外，所有步骤均在室温下进行。本方法所涉及各步骤所需的溶液与缓冲液详见本方案末尾。
1. 组织制备与切片
<ol>
 <li>快速断头并取出受试者的大脑，将其放入大小合适的塑料模具中。</li>
 <li>用Tissue-Tek包埋介质覆盖大脑，并迅速将塑料模具置于干冰/酒精浴中进行快速冷冻。冷冻组织可于-80°C保存至使用。</li>
 <li>使用冷冻切片机，将2至3片脑组织切片收集到带电荷的Superfrost Plus载玻片上，切片厚度应为10–12 μm。载玻片可于-80°C保存至使用。</li>
</ol>
2. 探针纯化用Sephadex G50柱的制备
Sephadex 柱可以从商业渠道购买，但我们在此提供一种低成本的柱制备替代方法，该方法将用于探针的纯化。
<ol>
 <li>用无RNase、经DEPC处理的水水合适量Sephadex G50粉末（例如，2 g粉末加入100 ml DEPC处理水中），短暂混匀后于室温下静置，使过量Sephadex G50沉淀。</li>
 <li>Sephadex G50沉淀后，移除上清液（上层水相）。</li>
 <li>重复上述步骤3–5次。</li>
 <li>最后一次洗涤后，将Sephadex G50沉淀用TE缓冲液重新悬浮（1:1比例），并于4°C保存至使用。</li>
 <li>将已灭菌的玻璃棉放入无菌1 ml注射器中，用推杆压实，在底部形成致密层，然后将注射器放入15 ml Falcon管中。</li>
 <li>充分混匀TE缓冲液中的Sephadex G50溶液，并将该溶液填充至注射器/层析柱中。</li>
 <li>以1000 rpm离心层析柱30秒。</li>
 <li>重复此操作，直至层析柱几乎完全被Sephadex G50珠填充。</li>
 <li>向层析柱中加入200 μl柱洗涤缓冲液，以1000 rpm离心2分钟。弃去穿流液。</li>
 <li>向层析柱中加入200 μl柱封闭缓冲液，以1000 rpm旋转2分钟。重复此步骤4–5次以平衡层析柱。若用Parafilm密封，层析柱可于4°C保存至使用。</li>
</ol>
3. 核糖探针的标记与纯化
以下详细说明单个核糖探针的制备与纯化过程。对于dFISH，每个探针的制备均采用相同的方法，区别仅在于其中一个探针使用地高辛（DIG）标记的UTP进行标记，而另一个探针则使用生物素标记的UTP进行标记。
<ol>
 <li>准备高浓度（> 150 ng/μl）且纯化的线性化cDNA溶液，用于生成正义（对照）或反义核糖探针。</li>
 <li>在1.5 ml离心管中加入0.5–1 μg纯化的cDNA模板、2 μl 5X探针标记缓冲液、1 μl 10X DIG（或生物素）标记混合物、0.5 μl RNasin和1 μl相应的RNA聚合酶，再用无RNase的（DEPC处理的）水将溶液终体积调至10 μl。</li>
 <li>将溶液置于37°C水浴中孵育2小时。</li>
 <li>向溶液中加入1 μl tRNA（储备液；20 μg/μl）和39 μl柱阻断缓冲液。</li>
 <li>准备Sephadex G50柱用于探针纯化。为此，向柱中加入50 μl阻断缓冲液，并在1000 rpm下离心10秒。 
 重复此步骤2–3次以平衡柱子（即，每次加入的50 μl缓冲液在离心后应全部回收）。</li>
 <li>将探针溶液加至Sephadex G50柱上，在柱底部放置一个新的离心管，于1000 rpm离心3分钟，收集纯化的50 μl核糖探针溶液。</li>
 <li>使用标准甲醛-琼脂糖RNA凝胶电泳或分光光度计评估标记核糖探针的质量和产量。</li>
</ol>
4. 固定后处理、乙酰化和杂交
<ol>
 <li>从 -80°C 冰箱中取出切片，置于室温下平衡。随后将切片浸入冰冷的新鲜配制的 3% 多聚甲醛溶液中孵育 5 分钟。</li>
 <li>用磷酸盐缓冲液（PBS）短暂漂洗切片两次。</li>
 <li>通过标准梯度酒精系列（70%、95% 和 100%；每步 2 分钟）对切片进行脱水，并使其自然风干。</li>
 <li>将切片在乙酰化溶液中孵育 10 分钟。</li>
 <li>用 2X SSPE 缓冲液漂洗切片 3 次。</li>
 <li>再次使用上述标准梯度酒精系列对切片进行脱水，并使其自然风干。</li>
 <li>配制适量的杂交溶液，并将两种核糖探针加入该溶液中（每种探针浓度为 1 ng/μl）。杂交溶液的总体积根据待杂交切片的数量确定（每张切片需 16 μl 杂交溶液）。</li>
 <li>将适量杂交溶液加至组织切片上，盖上盖玻片，确保组织上无气泡产生。</li>
 <li>将载玻片放入金属载片架中，将架浸入设定为 65°C 的石蜡油浴中过夜。确保盖玻片朝上（即载片架的侧面应与石蜡油容器底部接触）。</li>
</ol>
5. 杂交后洗涤
<ol>
 <li>次日，小心地将载玻片架从石蜡油浴中取出，并用氯仿短暂冲洗以去除载玻片上的过量油渍。</li>
 <li>将载玻片放入 2X SSPE 溶液中，5–10 分钟。盖玻片应在溶液中从载玻片上脱落。</li>
 <li>将载玻片转移至新的 2X SSPE 溶液中，在室温下放置 1 小时。</li>
 <li>将切片转移至含有 2X SSPE 加 50% 甲酰胺的溶液中。该溶液的温度应与前一晚杂交步骤所用温度一致。将载玻片在此溶液中保持 1.5 小时。</li>
 <li>将切片转移至预热至与杂交步骤相同温度的 0.1X SSPE 溶液中。在该溶液中孵育 30 分钟。重复此步骤再进行一次，每次 30 分钟。</li>
</ol>
6. 核糖探针的检测与可视化
<ol>
 <li>将载玻片转移至已添加0.3%过氧化氢的TNT缓冲液中，孵育10分钟。</li>
 <li>用TNT缓冲液洗涤切片，每次10分钟，共洗涤3次。</li>
 <li>使用DAKO笔在含有脑切片的区域周围画出一个封闭圈。重要的是，必须注意避免切片干燥。</li>
 <li>向每张载玻片上加入150 μl TNB缓冲液，并在湿盒中孵育30分钟。</li>
 <li>通过倾斜载玻片去除多余的TNB溶液。</li>
 <li>向每张载玻片上加入150 μl含辣根过氧化物酶标记的抗DIG抗体的TNB溶液，并在湿盒中孵育2小时。抗体浓度应在进行dFISH前针对每种目标转录本单独确定。</li>
 <li>用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。</li>
 <li>向每张载玻片上加入150 μl Alexa 594标记的酪胺工作液，并在湿盒中孵育1小时。该溶液应根据制造商说明进行配制。</li>
 <li>用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。</li>
 <li>将切片在已添加0.3%过氧化氢的TNT缓冲液中孵育10–30分钟。</li>
 <li>用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。</li>
 <li>每张载玻片加入150 μl TNB缓冲液，并在湿盒中孵育30分钟。</li>
 <li>通过倾斜载玻片去除多余的TNB溶液。</li>
 <li>向每张载玻片加入150 μl含辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体的TNB溶液，并在湿盒中孵育2小时。</li>
 <li>用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。</li>
 <li>向载玻片上加入150 μl Alexa 488标记的酪胺工作液，孵育1小时。该溶液应根据制造商推荐方法配制。</li>
 <li>用TNT缓冲液洗涤切片；每次10分钟，共3次。</li>
 <li>向切片上加入150 μl Hoechst溶液（以TNT缓冲液按1:1000稀释），并在湿盒中孵育2分钟。</li>
 <li>用TNT缓冲液洗涤切片；每次5分钟，共3次。</li>
 <li>用适合荧光成像的封片剂（如Vectashield或ProLong抗荧光淬灭封片剂）封片。</li>
</ol>
7. 典型结果
<img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="显示蛋白质表达模式的荧光显微镜图像；细胞中的绿色和红色标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 本图展示了在斑胸草雀脑中获得的代表性双荧光原位杂交（dFISH）结果。图中所示为来自尾侧中线新纹状体（NCM）的显微照片，该区域是鸣禽类动物中相当于哺乳动物听觉皮层的脑区。脑切片分别与针对小清蛋白（parvalbumin，A）的生物素标记核糖探针（用于标记一类抑制性神经元亚群）以及针对活性依赖基因zenk（B）的DIG标记核糖探针（该基因是声音刺激诱导神经元活动的可靠标志物）进行杂交。C）A图与B图的叠加显示了一群由听觉经验激活的抑制性神经元。箭头和空心箭头分别指示仅被其中一种核糖探针标记的细胞，星号标示的是同时表达两种目标转录本的代表性神经元。比例尺 = 25 μm。

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
<li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li>
<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们已采用该方案研究脊椎动物大脑的神经化学和功能组织方式，并确定与行为相关的感觉刺激如何影响成年大脑中神经元的基因组机制8-10。我们已成功将该方法应用于小鼠、大鼠和鸣禽的脑组织，但预计该方案也可轻松适用于来自多种脊椎动物物种的脑切片，甚至可能适用于非神经组织。有关获得可靠结果和最佳信号所需的关键对照，我们课题组已在其他文献中进行了详细阐述11, 12。

<table><tbody><tr><td>DEPC</td><td>VWR 国际公司</td><td>IC15090225</td><td>有毒物质</td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>VWR国际</td><td>BDH0506-4LP</td><td>有毒物质</td></tr><tr><td>T3 RNA聚合酶</td><td>罗氏集团</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶</td><td>罗氏集团</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl（1 M，pH 7.5）</td><td>VWR国际</td><td>IC816124</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449172</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺（1 M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA标记混合物</td><td>罗氏集团</td><td>NC9380805</td><td></td></tr><tr><td>生物素RNA标记混合物</td><td>罗氏集团</td><td>NC9440104</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05491</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>VWR 国际公司</td><td>95016-772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR 国际公司</td><td>101384-758</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>转运 (t)RNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td></td></tr><tr><td>10X MOPS</td><td>VWR 国际公司</td><td>14221-398</td><td>有毒物质</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>VWR国际</td><td>AAAL04737-36</td><td>有毒物质</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR 国际公司</td><td>SX0600-1</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺</td><td>VWR 国际公司</td><td>IC15216391</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>VWR 国际公司</td><td>MK242002</td><td>有毒物质</td></tr><tr><td>亚急性硬化性全脑炎</td><td>VWR 国际公司</td><td>82021-488</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>VWR 国际公司</td><td>JT4028-1</td><td>有毒物质</td></tr><tr><td>Poly A</td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>VWR 国际公司</td><td>IC15169491</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR 国际公司</td><td>BDH1109</td><td>有机溶剂</td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>有毒物质</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>VWR 国际公司</td><td>VW36901</td><td>有毒物质</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td></td></tr><tr><td>抗DIG-HRP</td><td>罗氏集团</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>抗生物素过氧化物酶</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP3010</td><td></td></tr><tr><td>TSA Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>T20935</td><td></td></tr><tr><td>TSA Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>T20932</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>VWR国际</td><td>200025-538</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>VWR 国际公司</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>徕卡显微系统</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus 载玻片</td><td>VWR 国际公司</td><td>89033-052</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;溶液&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;李&gt;柱洗涤缓冲液：10 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，0.05 mM EDTA，50 &amp;#x03BC;克/&amp;#x03BC;l tRNA，50 ml DEPC 处理水中含 0.1% SDS&lt;/li&gt;&lt;李&gt;柱层析封闭缓冲液：10 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，0.1 mM EDTA，溶于50 ml DEPC处理过的水中。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;TNT缓冲液：将60 ml 1 M Tris-HCl、18 ml 5 M NaCl和1.8 ml Triton X-100加入600 ml经DEPC处理的水中。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;TNB缓冲液：100 mM Tris-HCl，8.3 &amp;#x03BC;克/&amp;#x03BC;l BSA，0.15 M NaCl 和 3% Triton X-100 溶于 DEPC 处理水。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;TE缓冲液：10 mM Tris-HCl，pH 7.5，含1 mM EDTA，pH 7.5。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;乙酰化溶液：2.7 ml 三乙醇胺与 0.5 ml 乙酸酐加入 200 ml DEPC 处理水中。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;杂交溶液：50% 甲酰胺，2X SSPE，2 &amp;#x03BC;克/&amp;#x03BC;l tRNA，1 &amp;#x03BC;克/&amp;#x03BC;l BSA 和 1 &amp;#x03BC;克/&amp;#x03BC;l 聚腺苷酸，溶于经DEPC处理的水中。每张切片需要16 μl。&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

此处我们描述了一种双荧光的改良版本in situ杂交（dFISH）方法，该方法已针对在新鲜冷冻脑切片中检测两种目标mRNA进行了优化。我们课题组已成功应用此技术研究基因的共调控。更具体而言，我们利用该dFISH方法在单细胞分辨率水平上探究了中枢感觉通路的解剖学组织、神经化学特性以及感觉经验的影响。该实验方案已在小鼠、大鼠和鸣禽的脑组织中得到验证，预期可轻松适用于其他脊椎动物物种以及多种非神经组织。在本视频中，我们将详细演示该实验流程的主要步骤。

本方案涉及一种非放射性方法 原位 一种杂交实验流程，可在脊椎动物脑组织薄切片中以单细胞分辨率同时鉴定两种转录本。

本文介绍了一种改良的双重荧光原位杂交（dFISH）方法，该方法经过优化，可用于在新鲜...中检测两种目标mRNA

您好，我是罗切斯特大学AL帮助实验室的博士后研究员JA。我们将向您展示如何在新鲜冷冻的脑切片中进行原位杂交双酶消化，以在单细胞分辨率下同时检测两种mRNA转录本。该方法有助于回答神经科学领域中的相关问题，例如与脑环路的解剖学、功能、分子及神经化学组织相关的问题。尽管该方法可为AV脑神经元中的基因凝集提供见解，但也适用于其他系统，如啮齿类动物以及多种神经组织。开始此操作时，用适量水将SDX G 50粉末与RNAs充分水合。短暂混匀溶液，并在室温下静置 2 至 5 分钟。此步骤可在 Sedex G 50 沉淀后，将 SDX 磁珠与商用 Sedex 粉末中的葡萄糖分离。弃去上清液，最终洗涤后重复该过程 3 至 5 次，然后以 1:1 的缓冲液体积与磁珠体积比例将 SX G 50 溶液重悬于 TE 缓冲液中，并于 4°C 保存直至使用。接下来，准备层析柱。将经高压灭菌的玻璃棉放入一个无菌的1毫升注射器中，并用活塞压实，使其在底部形成一层紧密的垫层。然后将该注射器置于一个15毫升离心管中。使用配备 C 0 6 5 0 固定角度转子的 Beckman 离心机，在 1000 转/分钟的条件下离心 30 秒，用 Sedex G 50 溶液填充层析柱。离心后，每根层析柱中加入 200 µL 柱洗涤缓冲液，于 1000 转/分钟离心 2 分钟，进行洗涤。同前。最后向每根柱中加入200微升柱封闭缓冲液，以每分钟1000转的速度离心2分钟。重复此步骤4至5次，以平衡层析柱。将制备好的层析柱保存在4°C，直至RIBA探针标记完成并准备好进行纯化，用于此处展示的双荧光C2杂交（double fluorescence in C two hybridization）或DFISH实验。本实验中制备两种RNA探针，一种用洋地黄素苷（digoxigenin, DIG）标记，另一种用生物素（biotin）标记。首先配制Ribo探针标记反应液，并在37°C水浴中孵育2小时以启动探针标记反应。2小时孵育结束后，向每个标记反应体系中加入1微升浓度为20微克/微升的tRNA以及39微升层析柱封闭缓冲液。然后通过向每个 EDEX G 50 柱中加入 50 µL 封闭缓冲液，并在 2000 ×g 下离心 3 分钟，以准备探针纯化。重复此步骤 2 至 3 次以平衡色谱柱。当色谱柱准备就绪后，在柱底部放置一个新的 EEND 收集管。将探针溶液加入Sedex G 50柱中，以每分钟2000转的速度离心3分钟。为获得纯化的50微升Ribo探针溶液，需评估标记并纯化后的Ribo探针的质量和产量。在使用冷冻切片机进行杂交之前，将两到三张脑切片收集到带电荷的Super Frost Plus载玻片上。切片厚度应为 10 至 12 微米。载玻片可于 -80 °C 保存至使用。将切片置于新配制的冷 3% 多聚甲醛溶液中孵育 5 分钟。然后用 PBS 将切片短暂漂洗两次。接着将切片依次通过标准的酒精系列（70%、95% 和 100% 乙醇溶液）进行脱水，每种溶液中处理两分钟。脱水完成后，将切片置于新鲜配制的乙酰化溶液中孵育 10 分钟。然后用2倍SSPE缓冲液将切片冲洗三次，并在乙酰化后再次按照上述标准酒精系列对切片进行脱水。现在开始用核糖探针进行杂交。向组织上加入适量的杂交溶液，用盖玻片覆盖载玻片，并将载玻片放入金属载玻片架中。将切片架浸入设定为 65 摄氏度的矿物油浴中过夜。第二天，小心地将切片架从矿物油浴中取出，并用氯仿短暂冲洗以去除切片上的多余油渍。将载玻片置于2倍SSPE溶液中5至10分钟，以去除盖玻片。去除盖玻片后，将载玻片转移至新的2倍SSPE溶液中，并在室温下孵育1小时。在此孵育步骤开始前，将含有50%甲酰胺的2倍SSPE溶液预热至与杂交步骤相同的温度。在1小时孵育结束时进行下一步操作。将载玻片转移至预热的2倍SSPE溶液中，孵育1.5小时。在此孵育步骤开始时，将0.1倍SSPE溶液预热至与杂交步骤相同的温度。最后，将载玻片转移至预热的0.1倍SSPE溶液中，孵育30分钟，完成杂交后的洗涤步骤。重复此洗涤步骤一次。脑切片现可进行杂交核糖探针的检测与显色：向TNT缓冲液中加入0.3%过氧化氢，将切片在此溶液中孵育10分钟。随后使用脱蜡笔（deco pen）将切片在TNT缓冲液中清洗三次，每次10分钟。在含有脑切片的区域周围画一个圈。向每张载玻片上加入150微升TNB缓冲液，并将切片在此溶液中孵育30分钟。确保在此步骤中切片不会干燥。接下来，每张切片加入 150 µL 含有过氧化物酶偶联抗 DIG 抗体的 TT NB 溶液，将切片置于湿盒中孵育 2 小时。2 小时孵育结束后，用 TNT 缓冲液洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。每次洗涤后，向每张切片加入 150 µL Alexa 594 偶联 T IDE 工作液，并将切片置于湿盒中孵育 1 小时。一小时结束后，用TNT缓冲液洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。每次洗涤后，将切片在含0.3%过氧化氢的TNT缓冲液中孵育10至30分钟。过氧化氢溶液中的孵育时间取决于mRNA的丰度，应在进行D鱼实验前进行测试。然后用TNT缓冲液将切片洗涤三次，每次10分钟。每张切片加入150 µL TMB缓冲液，并将切片置于湿盒中孵育30分钟。通过倾斜切片去除多余的TMB溶液。加入150 µL含有辣根过氧化物酶偶联的二抗的TMB溶液，将切片置于湿盒中孵育2小时。然后用TNT缓冲液洗涤切片3次，每次10分钟。每次加入150 µL Alexa 488偶联的二抗工作液至切片，孵育1小时。然后用TNT缓冲液洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。现在两种核糖探针均已通过抗体标记，将切片置于150微升的宿主溶液中孵育2分钟。随后用TNT缓冲液洗涤切片，每次5分钟，共洗涤三次，加入适合荧光检测的封片介质（如Vector Shield或Prolonged Antifa），盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。这些代表性显微照片来自一项D鱼实验中的斑胸草雀脑切片，具体取自NCM区域，即鸣禽类中相当于哺乳动物听觉皮层的区域。脑切片使用两种探针进行杂交：一种是针对小白蛋白的生物素标记核糖探针，用于标记抑制性神经元的一个亚群；另一种是针对活动依赖性基因zinc的DIG标记核糖探针，该基因是声音刺激激活神经元的可靠标记物。两张图像的叠加显示了一群由听觉经验激活的抑制性神经元。箭头指示仅用 par 的核糖探针标记的细胞。白蛋白箭头指示仅用锌代表性神经元 RIBA 探针标记的细胞。同时表达两种目标转录本的共表达细胞用星号标记。在进行此操作时，重要的是要记住保持实验台清洁，并使用无污染的溶液、塑料制品和玻璃器皿。观看本视频后，您应能充分掌握如何在新鲜冷冻的脑组织切片中以单细胞分辨率同时检测两种MA物种，以研究人脑中的基因共调控。感谢观看本视频，祝您的实验顺利成功。

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双荧光原位杂交食脑切片

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双荧光原位新鲜脑切片中的杂交反应

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