Name: 海马脑片的器官型检查神经元损伤的文化模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学习使用器官型海马脑片培养技术建立神经元损伤模型，通过碘化丙啶染色和免疫荧光显微镜定量分析CA1、CA3及齿状回区域的神经元死亡情况。该方法保留了海马基本结构，适用于研究神经毒性机制和评估神经保护策略。

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由美国国家神经疾病与中风研究所（NINDS）、美国心脏协会、美国衰老研究联合会、玛氏基金会资助

1. 准备
开始前，准备好所需的手术器械、分离和培养用培养基，以及出生7天的大鼠或小鼠幼崽。该方案适用于大鼠和小鼠的制备。
(i) 材料与仪器
<ul>
	<li>手术剪（直剪，长 6 英寸，货号 RS6818，Roboz，Gaithersburg，MD）</li>
	<li>显微解剖剪（长 4 英寸，货号 RS5910，Roboz，Gaithersburg，MD）</li>
	<li>碳钢 Dumont 镊子（货号 RS-5045，Roboz，Gaithersburg，MD）</li>
	<li>改良玻璃“转移”移液管（移除巴斯德移液管底部并磨平边缘）</li>
	<li>聚四氟乙烯薄膜，裁剪为 2 英寸 × 2 英寸的正方形（Honeywell，货号 812071，Pottsville，PA）</li>
	<li>覆盖海绵，尺寸为 4 英寸 × 3 英寸（Kendall，货号 3157，Mansfield，MA）</li>
	<li>30 mm Millicell 膜插件（孔径 0.4 μm；Millipore，Bedford，MA）</li>
	<li>Mcllwain 组织切片机，配备双刃剃须刀片（McILwain 组织切片机，Vibratome Company，St. Louis，MO）</li>
	<li>倒置显微镜，配备 CCD 相机及图像分析软件</li>
</ul>
（ii）解剖液（DM；1 升，pH 7.3）
<table border="0">
	<tbody>
 	<tr>
			<td>汉克平衡盐</td>
			<td>1 小瓶 (95.2 g/1L) (Sigma: H2387)</td>
		</tr>
 <tr>
			<td>NHCO3 (4.2 mM)</td>
			<td>350 mg</td>
 </tr>
 <tr>
			<td>HEPES (10 mM)</td>
			<td>2.83 g</td>
 </tr>
 <tr>
			<td>葡萄糖 (33.3 mM)</td>
			<td>6.0 g</td>
 </tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素 (100×)</td>
			<td>10 mL</td> 
 </tr>
 <tr>
			<td>BSA (0.3%)</td>
			<td>300 mg</td>
 </tr>
 <tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>1.44 g</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
（iii）培养基（400 mL）
<table border="0">
	<tbody>
 	<tr>
			<td>MEM (Invitrogen 11575-032)</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>***Hank's Balance Salt (Invitrogen 24020-117)</td>
			<td>100 mL</td>
 </tr>
		<tr>
			<td>马血清 (Invitrogen 26050-070)</td>
			<td>100 mL</td>
 </tr>
		<tr>
 	<td>HEPES缓冲液 (1 M; Invitrogen 15630-080)</td>
			<td>5 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 		<td>青霉素/链霉素 (100倍浓缩液)</td>
			<td>4 mL</td>
 </tr>
		<tr>
 	<td colspan="2">***配制培养基前，向500 mL Hank's Balance Salt中加入12.8 g葡萄糖</td>
 </tr>
	</tbody>
</table>
（iv）动物 
出生后7天大的大鼠或小鼠幼崽，通常每次实验使用一窝。
2. 培养当天操作步骤
<ol>
	<li>所有解剖工具和Aclar膜在使用前必须用70%乙醇浸泡30分钟。解剖罩表面、刀片和组织切片机必须用乙醇消毒。</li>
	<li>准备若干（3–4个）6孔细胞培养板；每孔加入1 mL培养基，并在每孔中插入一张Millipore可渗透膜。将6孔板置于37°C培养箱中，待准备转移脑片时取出使用。</li>
	<li>准备若干（4–6个）60 mm培养皿，加入DM后置于冰上。</li>
	<li>迅速用剪刀断头，并将头部浸入70%乙醇中，通过颅骨矢状切口快速暴露大脑。小心取出脑组织并立即放入冷DM中。将脑组织分离为两个半球，将每个半球内侧朝下放置在覆盖海绵上约2–3秒。</li>
	<li>轻轻提起半球并将其放置于Aclar膜片上，然后置于组织切片机上；以冠状面将脑组织切成350 μm厚的切片。完成后，轻轻拿起带有切片脑半球的Aclar膜片，浸入冷DM中。</li>
	<li>在解剖显微镜下分离出海马区切片。大鼠应获得5个从前脑到后脑连续分布的海马切片，小鼠则应获得3–4个海马切片。</li>
	<li>从37°C细胞培养孵育箱中取出带有膜插件的6孔板。使用玻璃转移移液管将海马切片逐个转移至可渗透膜上。若过多DM被带至膜上，可用巴斯德移液管吸除多余液体。每张膜上放置5个海马切片。每种实验条件至少使用3个孔，即15个切片。</li>
	<li>将培养板置于37°C、5% CO的湿润培养箱中孵育12–14天，之后开始进行毒性实验。培养基可每周更换两次。</li>
</ol>
3. 在脑片培养中诱导并量化海马神经元损伤
<ol>
	<li>培养 12–14 天后，向培养基中加入 5 μg/mL 碘化丙啶（PI）。此步骤可用于观察和定量基础性细胞死亡。</li>
	<li>次日，定量每个海马脑片 CA1 亚区（以及根据需要可包括 CA3 或齿状回）的 PI 荧光强度，并获得代表基础性细胞死亡的平均 PI 荧光测量值（记为时间 = 0 小时，或 T0）。图像采集与定量分析可使用 OpenLab 软件（Improvision，英国），但也可采用其他图像采集与分析软件来量化荧光强度。</li>
	<li>在完成 T0 时间点的 PI 荧光图像采集后，立即采用您选定的方法诱导神经元损伤（我们曾使用 10 μM NMDA、缺氧-缺糖或 LPS 处理一小时以诱导神经毒性2,5）。在毒性刺激后，更换为含 5 μg/mL PI 的新鲜培养基，并将脑片继续培养过夜。</li>
	<li>第 3 天，定量实验条件下 24 小时（即 T24）的平均 PI 荧光强度。</li>
	<li>完成此次图像采集后，立即更换培养基，加入 10 μM NMDA 和 5 μg/mL PI，并将脑片继续孵育过夜，以达到最大神经元死亡程度。</li>
	<li>第 4 天，定量最大神经元死亡状态下的平均 PI 荧光强度，定义为 Tmax。按以下公式计算细胞死亡百分比：(T24 - T0) / (Tmax - T0)。</li>
</ol>
4. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="细胞死亡实验流程；PI荧光时间线及计算公式、显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. （A）海马体切片制备、后续实验性损伤及图像采集的时间线。（B）海马体切片在基础状态（T0）、经10 μM NMDA处理1小时后24小时（T24），以及再次暴露于10 μM NMDA持续24小时以达到最大神经元损伤时（Tmax）的代表性图像。

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在重复实验时，为确保结果具有可重复性和一致性，需遵循两个重要原则。首先，海马脑片在用于实验前应培养 12–14 天。在脑片分离过程中会引发显著的小胶质细胞反应，这些小胶质细胞在一段时间内保持活化状态，通常在体外培养第 10 天左右才恢复至静息的分支状形态in vitro 3,6。其次，碘化丙啶（PI）荧光平均强度与受损细胞数量成正比4。荧光信号在三个时间点进行连续测量：（i）T0 时，即在给予 NMDA 或氧糖剥夺（OGD）刺激之前，用于测定神经元自发性死亡的基础水平；（ii）T24 时，即在 NMDA、OGD 或其他刺激后 24 小时；（iii）Tmax 时，在脑片接受终末处理后进行测量，该处理为加入 10 μM NMDA 进行 24 小时的致死性孵育，以诱导最大程度的神经元死亡。随后，通过公式 (T24 - T0) / (Tmax - T0) 计算细胞死亡百分比。使用此方法将每一片脑片自身进行归一化处理至关重要，因为从脑...

用于检测神经元损伤的海马组织切片培养模型

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

器官型海马切片培养是一种 体外 一种用于研究神经元损伤机制的方法，其中海马体的基本结构和组成得以相对保留 1器官型培养系统可用于研究神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的作用，但作为一种 离体 制备过程未涉及血流影响或外周炎症细胞的募集。因此，该培养方法常用于研究海马锥体神经元的兴奋性毒性及缺氧性损伤，但也被用于研究炎症反应。本文描述了从出生后啮齿类动物脑组织制备海马脑片培养物的方法、施加毒性刺激以诱导神经元损伤的方法，以及检测与定量海马神经元死亡的技术。

器官型海马脑片培养模型是一种用于在多种实验范式中研究神经元损伤的体外模型。本文中，我们描述了制备脑片培养物以及定量神经元损伤的方法。

器官型海马脑片培养是一种体外方法，用于研究神经元损伤的机制，该方法保留了海马组织的基本结构与细胞组成……

本实验的总体目标是建立可用于模拟神经元损伤的海马组织切片培养模型，以响应多种刺激，包括NMDA、兴奋性毒性、缺氧缺糖或脂多糖和β-淀粉样肽等炎症刺激。该过程首先分离出生后幼鼠脑组织，并将每个半球切成冠状切片。实验的第二步是分离海马区域，并将其接种于6孔板中的膜插件上进行培养。切片培养完成后，使用碘化丙啶染色，计算自发性神经元死亡水平。最后，将脑片用神经毒性试剂处理，并重新染色以检测其对处理的毒性反应。最终，可通过免疫荧光显微镜定量碘化丙啶荧光，获得不同实验条件下海马体CA1区、CA3区和齿状回区域神经元死亡百分比的结果。该技术相较于现有的体外培养方法（如原代神经元培养）的主要优势在于，能够在海马基本结构相对完整的组织制备物中，研究神经元损伤的机制。第三种类型包括运动。在开始解剖之前，小胶质细胞和 ROY 均需保存。将一个 Millipore 可渗透膜插入每个样本中。向多个六孔组织培养板的每个孔中加入一毫升培养基。将培养板置于37摄氏度的培养箱中温育。将出生一天的七只幼鼠断头后，迅速浸入70%乙醇中消毒。使用显微解剖剪沿矢状方向剪开颅骨以暴露脑组织。用镊子快速取出脑组织，并转移至盛有冰冷解剖液的60毫米培养皿中。使用镊子将脑组织分离为两个半球。将每个半球内侧朝下放置在干燥的盖片海绵上 2 至 3 秒，以吸去多余水分。将脑组织转移至一张透明薄膜上，置于组织切片机的载物台上，从嗅球开始，以 350 微米厚度进行冠状切片。继续轻柔操作。轻轻提起A型琼脂糖块，将切片浸入盛有冰冷解剖液的新培养皿中。在解剖显微镜下，识别海马体——一种位于大脑皮层下方、紧邻纹状体的C形结构。使用镊子从每个冠状切片中分离出海马体。按照文中所述方法改装巴斯德吸管，将其用于将五个海马体切片转移至每一张膜上。随后插入已准备好的温热六孔板中。去除膜表面多余的培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养12至14天。在培养12至14天后，按照随附文本中的详细说明更换培养基，更换培养基后加入5微克/毫升的碘化丙啶（简称PI），以实现对基底细胞死亡的可视化和定量分析。将切片在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，在连接了CCD相机的倒置荧光显微镜下孵育过夜。此时以40倍放大倍数拍摄切片图像。成像后立即采集PI荧光信号，对应于零小时（T零）时细胞死亡的基础水平。随后，采用本实验首选的方法对切片进行神经元损伤诱导。将脑片置于含有10 µM NMDA的新鲜培养基中，在37°C和5% CO₂条件下孵育1小时。神经毒性处理后，更换为含有5 µg/mL PI的新鲜培养基。将切片在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜，进行神经毒性处理后的PI荧光成像。该时间点的平均荧光强度测量值代表细胞死亡水平。在实验性损伤24小时（即T 24小时）后，立即更换为含有10微摩尔NMDA和5微克/毫升的的新鲜培养基。PI 在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育脑片过夜，以实现最大程度的神经元死亡。采集 PI 荧光的最终图像，并获取该时间点的平均荧光强度测量值，代表细胞死亡的最大水平，即 Tmax。使用图像分析软件，按照随文所述方法定量分析感兴趣区域的PI荧光强度。此图为海马体CA1区基础性神经元死亡的PI染色代表性图像。此图为PI染色显示神经元死亡的代表性图像。经过10微摩尔NMDA处理1小时后24小时，可见染色更加明显，表明细胞死亡程度更高。该图像显示了在10微摩尔NMDA中过夜孵育后PI染色达到最大强度。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备有机的海马脑片以及如何检测神经元损伤水平。

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神经科学

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