Name: 暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶマウス網膜神経細胞のパッチクランプ記録法。暗順応スライス標本を用いて光刺激応答を測定し、網膜シグナル伝達と視覚情報処理のメカニズムを解明する。神経科学・電気生理学の研究に応用可能。

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この作品は、NIHのグラントEY17606（APS）によってサポートされていました。

1。準備電極<ol><li> 1M NaClに両方それらを浸漬し、それらの間に15Vの駆動〜20秒に1 Hzの正弦波を用いて、記録と参照電極を準備する</li><li>マイクロピペットプラー（サターインスツルメンツP - 97）を使用して、記録電極を行います。パッチピペットは、1.2mmの外径と0.69ミリメートル（サッタインスツルメンツ、カタログ番号B120 - 69 - 10）の内径とホウケイ酸ガラスを使用してください。電極の先端を通して直列抵抗を測定する。 MΩ〜12は、細胞体のためMΩ〜5〜直径の使用中の5μmの細胞体のための〜直径の使用中の20μm以下、ピペットの先端径を選択する標的細胞の大きさに基づいて。 </li><li>地上/参照電極を準備する。 1M NaCl中で、注射器を使用すると、（カタログ番号A7002、シグマ）3.5％寒天を含む1 mMのNaClを含む小さなセクションのポリエチレンチューブ（Intramedic、PE205）を記入してください。 Ag / AgCl参照電極上にこの寒天橋を置きます。 </li></ol> 2。準備ソリューション<ol><li>外部浴溶液、エイムズ"メディアを含む重炭酸塩（1 L）：エイムズの1本"培地（Sigma、カタログ番号A1420）、細菌を防ぐため、 炭酸水素ナトリウム1.9gの、ペニシリン-ストレプトマイシン（カタログ番号P0781、シグマ）の7 mLの成長。 〜280 mOsmに浸透圧を調整します。 </li><li>ソリューションをスライス、エイムズ"pH緩衝HEPES（1 L）を含有する培地：エイムズの1本"中、NaClの0.887グラム、HEPESの2.38グラム、ペニシリン - ストレプトマイシンの7 mLの。 1M NaOHおよび/または1M HClを用いて〜7.4にpHを調整する。 〜280 mOsmに浸透圧を調整します。 </li><li>カリウム-アスパラギン酸（K - ASP）ピペット内部の溶液（mMで）：125 K -アスパラギン酸、10のKCl、10 HEPES、5 NMG - HEDTA、0.5のCaCl 2、1 ATPとMg、0.2 GTPとMg、pHをするために調整されるNMG - OH、及び浸透圧を持つ〜7.3〜280 mOsmに調整されます。 </li><li>のdH 2 Oを150mlに溶けて、網膜を含む低ゲル化温度アガロース（5重量％）、寒天7.5gの（カタログ番号A7002、シグマ）を安定させるための寒天バックストップ</li></ol> 3。実験の日<ol><li>雪解け〜K - Aspを内部溶液と冷凍庫からお好みの蛍光体の1.5mLの。経験的に決定されるべき適切な濃度に蛍光体を希釈する。 </li><li>遮光貯蔵容器として水浴（30-32 ° C）に所定の場所にNaHCO 3を （〜200mL）を含むエイムズ"メディアを注ぎ、5％CO 2 / 95％O 2ガスとの平衡化</li><li> 、HEPESを含むエイムズ"メディアの〜110 mLのボトルをいっぱいに氷の上に位置し、100％O 2で平衡。 </li><li>ファラデーケージの上に温水タンクにNaHCO 3を含む残りのエイムズ"メディアを置き、そして5％CO 2 / 95％O 2ガスを用いて平衡化します。パラフィルムは、溶液の上部空間にガスをトラップするために使用されることがあります。 </li><li> HEPESと〜115℃でアガロースを融解することで熱溶液とエイムズ"メディアを25mLに、（カタログ番号A0701、シグマ）0.75gを添加することにより、低ゲル化温度アガロース（3％）の準備。気泡のない透明な溶液、及び水浴（〜42 ° C）にストアするまでかき混ぜる。 </li><li> K - Aspを内部溶液を記録ピペットを記入し、チップ抵抗を確認してください。 </li></ol> 4。実験を始める<ol><li>マウスを安楽死させるとすぐに湾曲したハサミを使って目を削除します。赤外線ゴーグルは、視覚的な色素の漂白を防ぐために、すべての手順を使用する必要があります。 </li><li>鉗子で目を押さえながら転がり、そして薄い両面刃を使用してからそれらを防ぐために、フィルター紙の上に目を置く、角膜にスリットを作る。 </li><li>すぐに眼球が破裂されると、エイムズ"メディアで満たされた皿に、彼らの目を移す。 </li><li>エントリポイントとして角膜にスリットを使用して、小さなはさみはレンズと硝子体を除去することができる後に、角膜の残りの部分を切り取るために使用されます。網膜は、アイカップにアタッチしたままになって、そして32で闇の中にアイカップを保管° Cを5％CO 2 / 95％O 2で平衡化したエイムズ"メディアにいることに注意してください。 </li></ol> 5。スライス<ol><li>アイカップのいずれかを二等分すると網膜色素上皮から網膜を解離する。組織が平らにできるように、網膜の辺を削除します。 </li><li>溶かした寒天と35ミリメートルのペトリ皿を埋めるためにラテックス電球と小さなガラスパスツールピペットを使用して、その一貫性をテストするために寒天を介して全体に鉗子をドラッグします。 </li><li>あなたは、寒天が固化し始めることができる場合： <ol class="lalpha"><li>寒天の上に網膜を転送します。 </li><li>網膜の周りに余分な溶液を吸収するキムワイプのねじれた部分を使用してください。 </li><li>直接網膜上に場所寒天の2〜3滴を、迅速にその周りに壁を形成するために、網膜上のプラスチック製のシリンダーを配置。寒天内で網膜を中心にしながらプラスチックの円筒の側面の下の追加溶かした寒天を滴らせる。 </li><li>ペトリ皿tを転送する冷却するために氷水浴をO。 </li></ol></li><li> 〜45秒後、氷水浴から組織を除去し、プラスチック製のシリンダーの外ブロック寒天を押し出すプランジャーを使用して、網膜から最も遠い側から押す。 </li><li>網膜を含む寒天の小さなブロックを切り取って試料ディスク上に寒天のバックスに対して所定の位置にブロックを瞬間接着剤に片側かみそりの刃を使用してください。 </li><li>振動ミクロトームのトレイに試料ディスクを転送し、網膜を持つブロックが完全に水没することができるようにトレイに氷冷エイムズのHEPESを注ぐ。 </li><li> 〜200μmの厚さと網膜のスライスは、最大ブレード振動速度で切断し、前進翼の速度は、各スライスで網膜を切って4〜5秒かかるように設定することができます。 </li><li>一度にそれぞれの使用可能なスライスのいずれかを削除する11号手術用メスの刃を使用してください</li><li>網膜を含む適切なスライスが録音室に配置されますと、それらを横断するナイロン糸とスライスのアンカーでダウン重み付けされています。ナイロン糸は、録画の遮るもののない網膜を残して、網膜の周囲の寒天を押したままにします。 </li><li>正立顕微鏡のステージに録音室を転送する、カーテンを閉じて、赤外カメラでスライスを表示するには、赤外光源をオンにします。 </li></ol> 6。録画<ol><li>一度良い網膜スライスは、（そのまま光受容体および適切な切削角を持つ）℃、5％で平衡化したCO 2 35 37に加熱される加熱されたエイムズ"メディアと5 mL / minのより高い率で網膜を灌流開始識別されます。 / 95％O 2。 </li><li>いくつかの表面の損傷は、スライスのプロセスに起因する明らかな可能性があります。細胞のこの通常薄い層が壊れた先端にピペットを用いて除去し、そして穏やかに死んだ細胞体を離れて吸うことができます。これは一般的に生きている細胞を下に明らかになります。その位置関心の地層中に配置されている健康な細胞体を識別する。 </li><li> KAsp内部溶液をマイクロピペットを記入し、ピペットの先端部を介して正（外側）の圧力を適用し、ダウンマイクロマニピュレーターを用いて、セルのレベルに録音室にピペットの先端を下げると。 </li><li>それは細胞膜をディンプルようにピペットの先端を移動し、高抵抗のシールを作るために穏やかな負の（内側）の圧力を適用する。全細胞モードは細胞に侵入する電極に負圧を適用することによって達成することができます。 </li><li> LEDを使用して網膜組織を刺激するし、光に応答を呼び起こすことができる。 </li><li>録音がピペット内部溶液中でフルオロフォアからの蛍光を想起させることによって作らされたセルを撮影。 </li></ol> 7。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ここでは、増加する強さの光の点滅に暗順応網膜ニューロンの光誘発電位が示されている。 <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。細胞は蛍光体、ルシファーイエローで満たされている網膜のスライスからの蛍光画像。誘発蛍光は、パッチのレコーディングが行われたから、細胞の形態を示しています。

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

脊椎動物の網膜からのスライスの記録は、何十年も1,2のために作られており、網膜回路が入射光をエンコードする方法のより深い理解を提供することにかなり成功している。かみそりの刃に直接振動ミクロトームで切断するのではなくの利点は、網膜のスライスが表面に少ないダメージを被ることがあります。吸引ピペットで、このダメージとターゲットだけ細胞のタイプのほとんどは、5,6を識別し、それが光に堅牢な応答が表示されている網膜回路、でその接続を保持する表面の下の健康な細胞を除去するのは簡単です。したがって、暗順応網膜のスライスからのパッチクランプ記録は、調査員が神経計算で識別されるセルのクラスが果たす役割を決定できるようにすることができます。

<table><tbody><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>アガー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Ames&amp;rsquo;培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

私たちの視覚経験は、私たちの網膜光受容体の視物質が光エネルギーの光子を吸収し、細胞膜中の環状ヌクレオチド依存性チャネルの閉鎖につながる細胞内イベントのカスケードを開始するときに開始されます。膜電位で生じる変化は、桿体と錐体シナプス端末の両方からの神経伝達物質の放出量の削減に順番につながる。光受容体の膜電位の光誘発変化が網膜の下流の活動につながるかを測定するために、科学者は数十年の1,2のための網膜スライス標本からの電気生理学的記録を行っている。過去にこれらのスライスは、ろ紙に接続されて網膜組織にカミソリの刃を使って手動でカットされている。近年でスライスの別の方法は、網膜組織が低ゲル化温度の寒天に埋め込まれているそれによって開発され、クールな解決策にスライスミクロトーム3,4を振動させる。この準備は少なく、表面の損傷と非常に堅牢な光誘発反応と網膜のスライスを生成します。ここでは、この手順を視覚的に色素を漂白避けるために、赤外光の下で実行する方法を文書化します。

ここでは、電気生理学的記録のためのマウスの網膜の暗順応のスライスを生成するための手順を説明します。

視覚体験は、網膜の光受容体にある視覚色素が光エネルギーの光子を吸収し、一連のカスケードを開始することによって始まります。

視覚体験は、網膜の光受容体にある視物質が光エネルギーの光子を吸収することから始まり、最終的に細胞膜上の環状ヌクレオチド依存性チャネルを閉鎖させます。これにより、桿体細胞と錐体細胞の両方から神経伝達物質であるグルタミン酸の放出が抑制されます。放出されたグルタミン酸は下流の網膜細胞によって感知され、これにより下流の信号を解析することが可能になります。安楽死させたマウスから眼球を摘出します。Sを単離してアガロースブロックに埋め込み、振動ミクロトームを用いてスライスします。次に、網膜スライスを顕微鏡下に配置し、LED照明で刺激します。シナプス電流または電位を測定するために、パッチクランプ記録を行います。一般的に、この手法に不慣れな方は、暗所での作業という複雑さが加わるため、習得に苦労します。そのため、プロセス全体を視覚的に確認できれば、言葉では説明しにくい感覚を掴むことができるでしょう。まず、使用する記録電極および参照電極のワイヤーに塩化銀の層をコーティングします。電極を1 Mの塩化ナトリウム溶液に浸します。次に、1 Hzの正弦波を持つ15 Vの電源を用い、電極間に15 Vの電圧を約20秒間印加します。マイクロピペットプラーを使用し、火炎研磨したBOシリカガラスからパッチピペットを作製します。パッチピペットの先端抵抗は、標的細胞のサイズに基づいて選択し、直径約20 µmの細胞体には5～10 MΩの先端抵抗を持つピペットを使用します。直径約5 µm以下の細胞体には、12～15 MΩの先端抵抗のものを使用してください。接地参照電極を準備するには、シリンジを用いて、1 mM 塩化ナトリウムで調製した 3.5% アガー溶液をポリエチレンチューブに充填します。次に、付属の書面プロトコルの指示に従い、以下の溶液を調製します。外部浴溶液、スライス溶液、アスパラギン酸カリウムピペット内部液、およびアガーバックストップです。すべての溶液は、使用するまで4 °Cで保存してください。実験当日に、約1.5 mLのコハク酸カリウム内部液を注入します。その後、希釈したFluorを添加します。重炭酸ナトリウムを含むAims媒質約50 millilitersを遮光保存容器に注ぎます。Aims媒質をガスで平衡化させるため、5%carbon dioxideおよび95%oxygenを含むガスタンクにプラスチックチューブを接続し、容器を30 to 32 degrees Celsiusの恒温水槽に入れます。次に、HEPESを含むAims媒質110 millilitersをボトルに満たし、氷上に置きます。100%酸素ガスを溶液にバブリングして、培地を等しくします。炭酸水素ナトリウムを含む残りのAimes培地を、ファラデーケージ上部の加熱リザーバーに入れます。チューブとボトル上部をパラフィルムで巻き、溶液上の空間にガスを閉じ込め、5%二酸化炭素、95%酸素ガスで平衡化させます。ガラス製エアディスパーションチューブを用い、0.75 gの低融点アガロースを25 mLのAIMs培地に加え、加熱して3%低融点アガロース溶液を調製します。攪拌しながら、溶液を約115 °Cまで加熱します。溶液から気泡が消え透明になったら、融解したアガロース溶液を42 °Cのウォーターバスに移します。倒立顕微鏡の上に記録チャンバーを設置します。5 cmのアガーブリッジを銀・塩化銀参照電極の上にスライドさせ、記録チャンバー内に配置します。ピペットを内部液で満たし、ピペットホルダーに装着し、さらにホルダーをアンプのヘッドステージに差し込み、ピペットを溶液中に浸すことで、ピペットチップの抵抗値を測定できます。生理学的記録において視覚色素を保存するため、すべての操作は赤外線ゴーグルを着用し赤外線灯下で行う必要がありますが、ここでは便宜上、室灯下での手順を示します。マウスを安楽死させた後、曲がり鋏を用いて速やかに眼球を摘出します。眼球が転がらないよう、フィルターペーパーの上に置きます。次に、ピンセットで眼球を固定し、薄い両刃のメスを用いて角膜に切り込みを入れます。眼球に穿刺したらすぐに、眼球をAIMS培地を満たした60 mmのペトリ皿に移します。角膜の切開口を進入路として、小さな鋏を用いて角膜の残りの部分を切り除きます。次に、水晶体と硝子体を摘出し、網膜が眼杯に付着したままであることを確認します。これを、32 °Cで95%酸素および5%二酸化炭素で平衡化したAIMS培地を満たした遮光容器に入れます。次に、10番のメスを用いて眼杯の半分を切り出します。網膜を網膜色素上皮から分離してください。組織を平らに固定するため、網膜の縁を取り除きます。ラテックスバルブ付きの小型ガラスパステールピペットを使用して、35 mmのペトリ皿に溶融した低融点アガロースを満たし、ピンセットをアガロース内で動かして硬さを確認します。アガロースが凝固し始めたら、網膜をアガロースの上に転移させます。次に、網膜に触れないように、ねじったキムワイプを使用して周囲の余剰溶液を吸収します。網膜の上にアガーをさらに2〜3滴直接滴下し、すぐにプラスチックシリンダーを配置して周囲に壁を作ります。網膜をシリンダーの中央付近に保持したまま、溶融アガーを追加で滴下し、シャーレを氷水バスに移して冷却します。30秒後、組織を取り出し、プランジャーを用いてアガーブロックを押し出し、網膜から最も遠い側から押し出します。片刃のカミソリを使用して、網膜を含むアガロースの小ブロックを切り出し、検体ディスク上のアガロース製ストッパーに接するように瞬間接着剤で固定します。検体ディスクを振動マイクロトームの台座にセットし、氷冷したAIMS溶液を台座に注ぎ、網膜を含むブロックが完全に浸かるようにします。ブレードの振動速度を最大に設定し、網膜を1回切り抜くのに4〜5秒かかるように前進速度を調整して、厚さ約200 µmの網膜スライスを作成します。11番のメス刃を使用して、ブロックから使用可能なスライスを1枚ずつ切り出します。網膜を含むスライスを記録室に配置し、固定します。スライスアンカーを用いて、ナイロン糸をスライスアンカーに交差させて固定します。網膜を遮ることのないよう、網膜周囲のアガロースを固定します。記録を行うため、記録チャンバーを正立顕微鏡のステージに移動させます。カーテンを閉じて赤外線光源を点灯し、赤外線感度カメラでスライスを観察します。顕微鏡下で、適切な切断角度で光受容体が保持されている網膜スライスを確認します。スライス工程により、表面に一部損傷が見られる場合があります。先端をカットしたピペットを用いて、死細胞の細胞体を静かに吸引して除去します。この薄い細胞層を取り除き、健全な生細胞層が現れたら、目的の層に位置する細胞体を特定します。ピペットチップを移動させて細胞膜にわずかな窪みを作り、緩やかな陰圧（内向きの圧力）をかけて、抵抗値の高いシールを形成します。その後、電極に陰圧をかけて細胞内へ侵入することで、ホールセルモード（whole cell mode）に移行します。次に、LEDを用いて網膜組織に光刺激を与え、応答を誘発させます。記録の終了後、ピペット内部溶液から細胞内に透析されたフルオロフォアに適した励起光を用いて画像をキャプチャします。ここでは、暗適応させた網膜ニューロンに対し、強度を増した光フラッシュを与えた際の光誘発電位を示しています。この図は、細胞にLucifer yellowを充填した網膜切片の蛍光写真であり、誘発された蛍光はパッチクランプ記録を行った細胞の形態を示しています。このビデオを視聴することで、暗順応させた網膜切片からパッチクランプ記録を行う際の複雑さについて、より深く理解できるはずです。この手順の目的は、制御された照明条件下で光誘発反応を測定することです。これを行うには、まず網膜を分離してアガーに埋め込み、次に単一細胞記録が可能な網膜スライスを作成する必要があります。

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