用于心肌组织工程的生物来源可注射材料的制备

由脱细胞心包和心肌组织制备的基质凝胶可保留天然的细胞外基质成分，包括多种蛋白质、多肽和糖胺聚糖。这些组织基质可用于组织工程。本视频中，通过脱细胞处理心包组织，制备出无细胞的细胞外基质凝胶。

随后对细胞外基质进行处理，以制备成可溶性的液态形式。接下来，在小型动物模型中测试该可溶性基质，以评估其作为可注射支架的可行性。组织学和免疫组织化学分析表明，在体内，注射后的材料可形成多孔纤维状支架，允许血管细胞浸润。

大家好，我叫 Sonia Zeki。我是加州大学圣地亚哥分校 Karen Chrisman 博士实验室的一名研究生。今天我们将从脱细胞组织中制备可溶性细胞外基质（ECM），并演示其在心脏组织工程应用中的体内测试。

这些技术对于开发用于治疗心力衰竭的可注射生物材料疗法至关重要。在心肌梗死后，由本实验室的兽医神经外科医生 Pam Shoot McGuffin 演示手术过程。现在我们开始吧。

首先对组织进行脱细胞处理，以保留细胞外基质（ECM）。将猪心包组织置于盛有去离子水的烧杯中，在室温下搅拌清洗30分钟。清洗后，将组织放入含有1% SDS和1%青霉素-链霉素的1× PBS溶液中，在室温下持续搅拌24小时。次日，将组织重新放回去离子水中，持续搅拌5小时，并在50 mL试管中振荡，直至所有泡沫完全消失。

血红素和伊红染色应显示脱细胞组织中细胞核的缺失。将剩余的脱细胞组织置于15至50毫升的锥形管中，然后将组织放入-80摄氏度的冰箱中。

将冷冻样品在极低压力和极低温度下进行冷冻干燥，直至完全干燥。根据所用系统及样品含水量的不同，干燥过程可能需要12至72小时。一旦脱细胞组织完全干燥，将其转移至Wiley Minim研磨机中。

使用40目筛网进行研磨，将组织研磨成细粉。当大部分样品通过滤网后，取下收集罐。此样品现称为细胞外基质或ECM粉末。

此时可进行第二次冻干步骤，若不立即进行下一步操作。这一步骤可确保记录的重量准确，用于溶解细胞外基质（ECM）。将所需量的ECM粉末称重至无菌冻存管中。

向含有 ECM 粉末的闪烁瓶中加入含每毫升一毫克的无菌过滤盐酸溶液 Pepcid，使 ECM 浓度达到每毫升 10 毫克。加入搅拌子，并将瓶子置于搅拌板上。

持续搅拌 48 至 60 小时，期间使用无菌 WHE 勺子或刮刀定期刮下瓶壁上的残留物，以确保所有 ECM 粉末充分消化。随着 ECM 被消化，其将逐渐进入溶液。

一旦细胞外基质（ECM）被溶解，立即将样品置于冰上，并使用氢氧化钠和盐酸调节pH至7.4。pH调节完成后，加入10倍浓度的PBS，使溶液的最终浓度为1倍PBS。例如，若含有900微升（µL）的ECM溶液，在调节pH后，应加入100微升（µL）的10倍PBS。

通过计算用于中和的添加体积以及用于测试 pH 值的移除体积，确定溶解的细胞外基质（ECM）溶液的浓度。然后加入一倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS），以达到此处所需的终浓度：6 毫克/毫升。

手术当天，用带有30号针头的0.1毫升注射器准备75微升溶解的细胞外基质（ECM）注射液。使用2.5%氟烷维持Harlan dolly雌性大鼠的麻醉状态。涂抹眼膏保护眼睛，然后通过夹捏脚趾确认麻醉效果。

通过下腹部皮下注射给予3 mL乳酸林格液以补充水分。随后，将动物仰卧位放置于手术台上，并轻轻固定四肢。使用电推剪去除腹部毛发，并用吸尘器清理散落的毛发。

从剑突至腹部右下侧沿对角线方向，进行一系列50 µL的2%利多卡因注射。然后使用聚维酮碘从腹中部开始向外周擦拭消毒三次。再用异丙醇重复擦拭消毒三次。

然后使用带有预制圆形窗口的手术巾覆盖动物，并用手术巾固定。使用10号手术刀。

从剑突开始，向腹部右下方做一条3至4厘米长的切口。找到剑突，沿肌肉向右垂直向下分离，注意避免损伤右侧的大血管。接着，使用剪刀横向剪开肌肉，暴露膈肌。

使用一根36英寸长的3-0号薇乔缝线和一把止血钳时，需小心避免触碰肝脏。将一根针穿过剑突，并将缝线拉至一半穿过剑突。将缝线两端用胶带粘在一起，并固定在动物上方后方的某一点上，提起剑突，暴露膈肌，再使用另一根36英寸长的3-0号薇乔缝线完成操作。

将针穿过靠近剑突的肌肉，再次拉过并固定到手术台右侧的另一位置，充分暴露手术腔隙。接着，使用一对小型鼠齿显微镊夹住膈肌中心，将其向外牵拉，并用钝头剪刀做一微小切口。一旦形成此孔洞，肺组织便会回缩。

沿膈肌垂直做2至3厘米的切口，以暴露心脏。然后将一根3英寸的棉签插入胸腔左侧，并将肺组织推开。使用巾钳固定棉签位置。

使用另一根棉签将右肺移开，以找到心包膜囊。然后使用一对微型镊子和一对大型锯齿状镊子，撕开心包膜囊，暴露心脏的心尖。用右侧带齿微型镊子夹住心尖，并将针头斜面向左插入，注射溶解的基质。

从心尖向上三分之一处，平行于心外膜表面进针。注意避免损伤心脏大静脉。注射溶解后的基质凝胶，拔出针头前等待数秒钟。

注射部位的组织应变白，用棉签擦去胸腔内的血液，使用弯头显微止血钳移除夹住右肺的止血钳和棉签，用一段30英寸长的5-0普理灵缝线打一个初始结。然后使用鼠齿显微镊子，配合带圆锥形针头的连续缝合线关闭膈肌，最后完全闭合。插入PE-160吸引管，并使用10毫升注射器抽吸胸腔以排出气体。

收紧缝线时，膈肌应呈凹面。将氟烷的浓度调至1%。取出用于保持切口开放的两根3-0薇乔缝线。用棉签或无菌纱布擦去多余液体，使肌肉保持湿润。

使用一段新的3-0缝线以间断缝合方式关闭肌层。随后关闭异氟烷气体。清洁手术区域，并使用缝钉关闭皮肤。

然后在切口部位涂抹三联抗生素软膏。将大鼠置于100%氧气环境中使其恢复。当动物开始自主呼吸并绕过呼吸机时，拔除气管插管。

当动物恢复站立后，皮下注射盐酸布托啡诺镇痛剂，剂量为每千克体重0.05毫克，并将其放回饲养笼中，笼内铺有无菌毛巾。注射可溶性基质凝胶的大鼠心脏组织在不同时间点取材后进行切片，并用苏木精、伊红（H&E）染色以进行大体组织学分析。术后早期时间点可见注射区域呈现粉红色的纤维网络结构，而在后期时间点则表现为间质性扩散。

两周后可观察到细胞流入。可见注射基质的降解。若在注射前用生物素标记细胞外基质（ECM），则可通过辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉亲和素对生物素进行染色，更直接地观察基质注射区域内的血管长入及形成情况。

此处的切片已用fitzy进行共染色。共轭选择素（显示为绿色）可结合内皮细胞，抗平滑肌肌动蛋白抗体（显示为红色）。干细胞也可能在注射区域附近被识别出来。

此处通过C kit免疫组织化学染色对它们进行了可视化。观看本视频后，您应能够充分理解如何从脱细胞组织中制备可溶性细胞外基质，并在体内测试其用于心脏组织工程的应用。请注意，尽管我们使用心包组织，但该通用方案可经修改后用于任何来源的组织。

感谢观看，祝您的实验顺利。