Name: 心肌组织工程生物衍生的注射材料的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学习制备脱细胞心包组织基质凝胶的方法，用于心脏组织工程研究。该技术通过大鼠心肌内注射评估可注射支架的可行性，为心力衰竭治疗提供生物材料方案。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）医学研究路线图计划中的NIH主任创新者奖项目（资助号：1-DP2-OD004309-01）的部分支持。S.B.S-N. 感谢美国国家科学基金会（NSF）为其提供的研究生研究奖学金。

1. 组织预处理制备
<ol class="lalpha">
<li>	在使用本方案之前，必须已完成所选组织的脱细胞处理。本示例中，采用去离子水（DI水）中的低渗和高渗冲洗结合十二烷基硫酸钠（SDS）对新鲜的猪和人的心包组织样本进行脱细胞处理。</li>
<li>	具体而言，首先将猪心包组织在去离子水中洗涤30分钟，然后在含1% SDS的磷酸盐缓冲液（PBS）中持续搅拌24小时，随后用去离子水冲洗5小时。对于人心包组织，首先在去离子水中冲洗30分钟，然后在含1% SDS的PBS中持续搅拌60–65小时，接着进行过夜的去离子水冲洗。将所有样本从最终溶液中取出后，在流动的去离子水中再次冲洗1。</li>
<li>	为验证脱细胞效果，取一小块组织，用O.C.T.包埋剂新鲜冷冻，并在整个样本中每隔100 μm切取10 μm厚的组织切片，用于组织学分析，方法如先前报道34-36。</li>
<li>	使用苏木精和伊红（H&amp;E）染色法检测组织中细胞核的缺失情况。也可使用荧光染料Hoescht 33342（1.0 μg/mL）对DNA进行染色以验证H&amp;E结果；简要步骤为：固定切片，复水并用水冲洗，染色10分钟，然后充分冲洗并在避光条件下保存。或者，可使用商品化试剂盒（如Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒），该试剂盒可用于定量样本中的总DNA含量。</li>
</ol>
2. 可注射细胞外基质的制备
<ol class="lalpha">
<li>	冻干
<ol class="lroman">
<li>	在适当处理后，使用液氮冷冻脱细胞样本，或于 -80 °C将样品冻干至完全干燥。根据您的系统及样品的含水量，此过程可能需要12至72小时。</li>
</ol>
</li>
<li>	研磨
<ol class="lroman">
<li>	完全干燥后，使用Wiley Mini Mill将干燥的ECM研磨成细粉。根据实验需求选择合适的筛网孔径；此处使用40目筛网。当大部分样品通过筛网后，取下收集罐，其中含有研磨后的ECM粉末。若样品量较少，可采用多种方式从研磨机中取出剩余样品；此处使用棉签清除滞留在研磨机固定刀片后的ECM。</li>
<li>	务必确保研磨机清洁且无任何残留物。同时需确保研磨机和样品完全干燥；任何残留水分都会导致细胞外基质（ECM）聚集结块，从而影响研磨效果。细胞外基质可能从空气中吸收水分，因此应从冻干机直接转移至研磨机进行操作。</li>
</ol>
</li>
<li>	消化
<ol class="lroman">
<li>	为了制备注射用细胞外基质（ECM），需将粉末用胃蛋白酶消化。以下方案经Freyetes修改而来， 等 (2).</li>
<li>	保持产品尽可能无菌至关重要，因为该产品将被注射使用 体内 污染可能导致并发症。因此，应使用无菌小瓶和称量勺，并在使用前对所有溶液进行过滤。研磨后、消化前进行冻干步骤也有助于维持无菌状态。</li>
<li>	称取所需量的ECM粉末至合适的闪烁瓶中。对于总体积小于1 mL的样品，建议使用2 mL的闪烁瓶；对于较大体积，则使用20 mL的闪烁瓶。这可确保瓶底有足够的液体以实现有效搅拌。</li>
<li>	称取所需量的胃蛋白酶至闪烁瓶中。加入 0.1 M HCl，使胃蛋白酶浓度达到 1 mg/mL。使用前确保胃蛋白酶完全溶解（无颗粒），可通过涡旋胃蛋白酶溶液加速溶解。</li>
<li>	将胃蛋白酶/HCl 溶液加入含有 ECM 粉末的闪烁瓶中，使 ECM 的浓度为 10 mg/mL。</li>
<li>	持续搅拌溶液60-65小时，期间定期使用称量勺或刮刀刮下瓶壁上的物质。</li>
</ol>
</li>
<li>	pH 调节
<ol class="lroman">
<li>	此步骤旨在将液态基质材料调节至生理pH值，并使胃蛋白酶失活，防止其进一步降解细胞外基质。同样，务必使用经滤膜过滤的、以Millipore水配制的溶液。</li>
<li>	加入1 M NaOH至原体积的1/10。此时检测pH值，并加入少量（2-10 μl) NaOH 或 HCl，直至达到目标 pH 值（7.4）。记录中和过程中添加或为 pH 检测移除的所有少量液体。溶液中和后，加入 10x PBS，使其终体积占总体积的 1/10（即当前体积的 1/9）。测定可注射 ECM 的浓度，然后加入 1x PBS，调节至目标终浓度，此处为 6 mg/mL。</li>
<li>	可通过SDS-PAGE、Blyscan糖胺聚糖比色法测定以及质谱分析对可注射型细胞外基质进行表征。</li>
<li>	此时，可将基质材料注入 在体 用于心肌组织工程的支架构建。</li>
</ol>
</li> 
<li>	生物素标记
<ol class="lroman">
<li>	可在注射前用生物素标记细胞外基质，以便于观察注射后的细胞外基质。</li>
<li>	配制10 mM的生物素溶液，并按0.3 mg/mg的比例加入可注射的ECM中。ECM应调整至所需的注射浓度。若注射浓度为6 mg/mL，则加入 40 μL 每毫升 ECM 中加入生物素。注射前，将生物素-ECM 溶液置于冰上至少 1 小时。</li>
</ol>
</li>
<li>	所有处理步骤均可在室温下进行。为防止可注射基质发生凝胶化，pH调节步骤可在冰上操作。 </li>
</ol>
3. 心肌注射
<ol class="lalpha">
<li>注射准备
<ol class="lroman">
<li>对于本实验所用的雌性大鼠（225–250 g），在装有30号针头的0.1 mL注射器中配制75 μL pH 7.4的可注射细胞外基质（ECM）。若使用雄性大鼠（375–400 g），则可注射90 μL。</li>
<li>所有外科器械应在手术前灭菌；本实验使用已高压灭菌的外科器械包，其中包含所有必需工具。</li>
</ol>
</li>
<li>手术当天，使用5%异氟烷对Harlan Sprague-Dawley大鼠进行麻醉，通过耳镜进行气管插管，并在整个手术过程中以2.5%异氟烷维持麻醉状态。</li>
<li>向动物眼部涂抹人工泪液软膏，以防止干燥和毛发刺激。手术期间通过皮下注射给予3 mL乳酸林格氏液以维持水化，注射部位为下腹部区域。</li>
<li>将动物仰卧位固定于手术台上，轻轻用胶带固定四肢。使用电动剪毛器去除腹部毛发，并在消毒前用吸尘器清除松散毛发。</li>
<li>沿胸骨剑突至腹部右下侧的斜线，分次注射一系列小剂量（每针约50 μL）2%利多卡因。随后用聚维酮碘自中心向外环形擦拭三次，再以70%乙醇重复擦拭三次。使用带有预制圆形窗口的手术巾覆盖动物体表，必要时用巾钳固定。</li>
<li>使用10号手术刀从剑突至腹部右下侧做3–4 cm长切口。定位剑突后，沿肌肉层向右垂直解剖，注意避开右侧的大血管。穿透肌肉层后，使用剪刀横向剪开肌肉，暴露膈肌，操作时注意避免损伤肝脏。</li>
<li>取一段36英寸长的3-0 Vicryl缝线和一把止血钳，将缝针穿过剑突并拉至一半长度。将缝线两端粘在一起，并固定于动物上方后方某一点，从而抬高剑突并暴露膈肌。另取一段36英寸长的3-0 Vicryl缝线，将缝针穿过靠近剑突的肌肉组织，同样拉出并固定于手术台右侧的另一位置，充分暴露手术腔隙。</li>
<li>此时应能透过膈肌观察到心脏。使用小型鼠齿显微镊夹住膈肌中央部位，将其向外牵拉，并用钝头剪刀做一小切口。必须使用非常钝的剪刀，以防刺破肺组织。完成此小孔后，肺组织会自然回缩，随后可沿垂直方向在膈肌上做2–3 cm切口，以充分暴露心脏。</li>
<li>将一根3英寸棉签插入体腔左侧，推开肺组织，并用巾钳固定棉签位置。再用另一根棉签移开右肺，以暴露心包膜。使用显微镊和大齿状镊撕开心包膜，暴露心脏心尖部。若动物此前已接受心肌梗死造模手术，则心包膜可能已缺失。</li>
<li>用鼠齿显微镊夹住心脏心尖部，从心尖向上约三分之一处注射液态基质材料。进针方向应与心外膜表面平行，针尖斜面朝左进行注射。务必避开心脏大静脉。注射后停留数秒再拔出针头。注射部位应可见组织变白。</li>
<li>清理体腔内血液，移除固定右肺的巾钳和棉签。使用弯头微血管钳和鼠齿显微镊闭合膈肌。先打一个结，然后使用齿状镊和微血管钳配合，以带锥形针的3-0缝线连续缝合关闭膈肌。在完全闭合前，插入PE160吸引管，连接10 mL注射器，在收紧缝线的同时抽吸胸腔气体。</li>
<li>若胸腔排气充分且闭合良好，膈肌应呈凹面状。若膈肌呈凸起状，则提示腔内仍有残留气体。</li>
<li>此时可将异氟烷浓度下调至1%。</li>
<li>取出用于牵开体腔的两根3-0 Vicryl缝线。用无菌水润湿肌肉组织，并用棉签或无菌纱布擦去多余液体。使用新的3-0缝线间断缝合肌肉层。</li>
<li>此时可关闭异氟烷麻醉。</li>
<li>用无菌水清洁术区，使用皮肤钉合器关闭皮肤切口。若皮肤钉可能干扰后续研究，也可使用5-0普理灵（proline）缝线。此种情况下，应使用反向切割（RC）针进行间断缝合皮肤。无论采用何种方式，均应在闭合切口上局部涂抹外科粘合胶。</li>
<li>使用棉签将三联抗生素软膏涂抹于切口部位。</li>
<li>让动物在100%氧气环境下恢复。</li>
<li>当动物开始自主呼吸并对抗呼吸机时，拔除气管插管。</li>
<li>待动物恢复胸卧位后，皮下注射0.05 mg/kg盐酸布托啡诺，并将其放回饲养笼中，笼内铺有无菌毛巾。</li>
<li>动物术后应接受观察与护理。</li>
<li>在设定的时间点处死动物，取出心脏进行分析。取心脏短轴横截面，可进行苏木精-伊红（H&amp;E）染色以进行大体组织学分析。在早期时间点，注射区域表现为粉红色、呈间质性扩散的纤维网络结构。在后期时间点（2–3周后），可见细胞浸润及注射基质的逐步降解。若在注射前已用生物素标记ECM，则可通过HRP标记的链霉亲和素染色直接可视化生物素信号。免疫组织化学染色可用于鉴定注射区域内的特定细胞或结构；本实验中切片经双重染色处理：使用FITC标记的异凝集素（可结合内皮细胞并发出绿色荧光）和抗平滑肌肌动蛋白抗体联合AlexaFluor二抗（标记平滑肌细胞，呈红色荧光）进行共染色。</li>
</ol>
4. 代表性结果
先前对以该方法制备的基质材料进行的表征表明，多种大分子得以保留。具体而言，通过质谱分析鉴定出多种纤维状蛋白质和糖蛋白（表1）。如果按照本方案处理后的基质材料不再含有复杂的大分子组合，则可能是所采用的脱细胞化方案过于剧烈。完全冻干后，干燥的心包ECM外观类似非常坚硬且皱缩的纸张。其他类型的组织则可能形似泡沫填充颗粒。若研磨充分，ECM应能通过筛网并收集于底部的容器中。若样品中仍有水分残留，ECM会结块并卡在研磨腔内。消化完成后，ECM溶液应呈乳白色，且完全无可见颗粒物。其黏度也会略高于单独的HCl溶液。如果ECM消化不充分，离心管中仍会存在较大颗粒物；或者ECM可能从溶液中析出沉淀。调节pH后，溶液无明显可见变化，ECM仍为浑浊的均一液体。若溶液开始凝胶化，其黏度将升高，导致难以甚至无法将材料吸入注射器中。若出现此情况，应在冰上操作pH调节步骤，并使用预冷的溶液。注射剂制备完成后，应将其置于冰上保存直至使用。若注射成功，针尖周围区域会变白，并可见一个小的团块。若未观察到该现象，则注射可能进入了心腔而非心壁。注射后缝合动物体腔时，仔细闭合膈肌是最关键的步骤。若操作正确，膈肌将紧贴肺部并呈凹面状。若肺内残留空气，膈肌将保持凸面，或出现局部膨出。在注射后早期时间点（注射后30分钟至4小时）观察注射区域的组织学切片时，应可见一个粉红色、富含纤维且无细胞的区域——此即注射后重新组装的基质材料（图2）。该网络结构常呈间质性扩散，可能在多个切片中均可见。若仅观察到极小范围的基质凝胶，可能的原因是部分注射未准确到达心肌壁目标位置，而是注入左心室腔内或从注射部位漏出。此外，间质扩散的程度还可能取决于凝胶形成的时间。
<img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig1.jpg" alt="SDS-PAGE 凝胶电泳图，显示按分子量分离的蛋白质。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结果。（A）分子量标准。（B）尾部大鼠I型胶原蛋白（2.5 mg/mL）与溶解的人（C）和猪（D）心包细胞外基质（ECM）（7 mg/mL）的比较。注意心包基质样品中除胶原蛋白外，还存在多种其他蛋白质和多肽。
<img src="/files/ftp_upload/2109/2109table1.jpg" alt="蛋白质鉴定表；在 HPM 和 PPM 样品中鉴定出双糖链蛋白聚糖、胶原蛋白和弹性蛋白。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1. 通过质谱鉴定的细胞外基质成分。
<img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig2.jpg" alt="组织学比较，显微镜图像显示组织切片A和B，箭头指示相应结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 心肌注射： 体内 凝胶化。H&amp;人（A）和猪（B）心包基质注射液凝胶化后的伊红染色 体内 45 分钟后。箭头指示基质位置，染色呈比心肌更浅的粉红色。比例尺为 500 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig3.jpg" alt="显示细胞蛋白定位的荧光显微镜图像；组织切片中的对比分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 血管细胞浸润。注射后两周，在人源（A-C）和猪源（D-F）基质凝胶中对血管进行荧光染色。内皮细胞呈绿色标记（A，D），平滑肌细胞呈红色标记（B，E）。C和F为合并图像。比例尺为100 μm。白色虚线表示基质注射区域，该区域由邻近切片的H&amp;E分析确定。
<img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig4.jpg" alt="显示组织切片中细胞定位的荧光显微镜图像，包括细胞核和标记物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 基质注射区域内的干细胞。Hoescht 染色显示细胞核（蓝色），c-kit（绿色）用于鉴定人（A）和猪（B）基质注射区域中的干细胞。比例尺为 50 μm。

<ol><li>Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+an+injectable+pericardial+matrix+gel%3A+A+potentially+autologous+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Tissue Engineering. , (2009).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).</li>
<li>Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+decellularization+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+the+porcine+aortic+valve+leaflet%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet.</a> Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).</li>
<li>Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).</li>
<li>Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+fibrin+scaffold+improves+cell+transplant+survival%2C+reduces+infarct+expansion%2C+and+induces+neovasculature+formation+in+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).</li>
<li>Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glue+alone+and+skeletal+myoblasts+in+a+fibrin+scaffold+preserve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction.</a> Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).</li>
<li>Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rodent+model+of+myocardial+infarction+for+testing+the+efficacy+of+cells+and+polymers+for+myocardial+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction.</a> Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).</li>
<li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
</ol>

动物使用：本研究中的所有实验均按照加州大学圣地亚哥分校机构动物照护与使用委员会以及美国实验动物照护评估认证协会发布的指南进行。

该方法可用于制备源于生物材料的可注射支架，以用于心肌组织工程。尽管这些方法最初是为心肌基质凝胶的制备及in vivo测试而开发，并在此以心包基质凝胶为例进行展示，但本方案可适用于任何组织类型，前提是该组织能够被适当去细胞化。在应用这些方法之前，应完成去细胞化处理并加以验证，因为基质凝胶中残留的DNA可能引发不必要的免疫反应。去细胞化材料的方法有多种，该领域已有若干优秀的综述文献3, 4。
制备基质凝胶时，必须确保样品完全冻干，因为任何残留的水分都会影响研磨。此外，为避免吸入细胞外基质（ECM）粉末，研磨时应始终佩戴口罩。最后需要注意的是，当基质凝胶用于体内（in vivo）研究时，应尽可能以无菌方式操作，以降低污染导致感染的风险。如果将本方案修改用于不同类型的组织，则需要优化某些参数。例如，可以调整ECM的浓度——某些组织需要较高浓度才能形成凝胶，而另一些组织可能在较低浓度下即可凝胶化。此外，若所用胃蛋白酶的活性强度有显著差异，则所需的消化时间和胃蛋白酶浓度也可能需要相应调整。
<p class="jove_co...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p6887-1G</td><td>冻干粉</td></tr><tr><td>生物素</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>21217</td><td></td></tr><tr><td>中性亲和素-HRP</td><td>Thomas Scientific</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备：&lt;/strong&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiley小型研磨机</td><td>Thomas Scientific</td><td>3383L10</td><td></td></tr><tr><td>Labconco冻干机</td><td>Labconco Corp.</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术用品：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-154-16</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格氏液</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>003966</td><td></td></tr><tr><td>KY润滑胶</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>28658</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因，2%</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>17767</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>人工泪液软膏</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9860843</td><td></td></tr><tr><td>三重抗生素软膏</td><td>Fisher Scientific</td><td>19082795</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>60307-120-25</td><td></td></tr><tr><td>耳镜</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>008699</td><td></td></tr><tr><td>三通阀</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>006245</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicril缝线</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>J327H</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Proline缝线</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>s-1173</td><td></td></tr><tr><td>反向切割（RC）针</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8684G</td><td></td></tr><tr><td>微型止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>鼠齿微型镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11084-07</td><td></td></tr><tr><td>10号手术刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>10110-01</td><td></td></tr><tr><td>钝头剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14108-09</td><td></td></tr><tr><td>锐利弯头剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>大型锯齿镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>PE160吸引管</td><td>BD Biosciences</td><td>427430</td><td></td></tr><tr><td>电动剪毛器</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>21608</td><td></td></tr><tr><td>皮肤缝合钉/缝合器</td><td>Ethicon Inc.</td><td>PRR35</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;通用耗材：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 M HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 mL注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术粘合剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术单</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>巾钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型手持式真空泵</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于心肌组织工程的生物来源可注射材料的制备

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

本方案提供了用于心肌组织工程的可注射细胞外基质（ECM）凝胶的制备方法。简言之，脱细胞组织经冷冻干燥、研磨、酶消化后，调节至生理pH值。冷冻干燥可完全去除组织中的水分，得到干燥的ECM，随后可用小型研磨机将其研磨成细粉。研磨后，ECM粉末经胃蛋白酶消化形成可注射基质。调节pH至7.4后，该液态基质材料即可注射入心肌组织。既往表征实验结果表明，由脱细胞心包和心肌组织制备的基质凝胶可保留天然ECM成分，包括多种蛋白质、多肽和糖胺聚糖。鉴于该材料在组织工程中的应用，in vivo表征尤为重要；本文提供了一种在小型动物模型中向左心室（LV）游离壁进行心肌内注射的方法，以分析宿主对基质凝胶的反应。通过膈肌入路进入胸腔，并在心尖稍上方的左心室游离壁进行注射。注射前可通过生物素标记该生物来源的支架材料，随后使用辣根过氧化物酶偶联的中性亲和素对组织切片染色，并通过二氨基联苯胺（DAB）显色进行观察。注射区域的分析也可通过组织学和免疫组织化学染色完成。通过上述方法，既往研究证实心包和心肌基质凝胶可在注射区域形成纤维状多孔网络，并促进血管生成。

从脱细胞组织制备可注射基质凝胶并将其注射入大鼠心肌的方法 体内 如上所述。

本方案提供了用于心肌组织工程的可注射细胞外基质（ECM）凝胶的制备方法。

由脱细胞心包和心肌组织制备的基质凝胶可保留天然的细胞外基质成分，包括多种蛋白质、多肽和糖胺聚糖。这些组织基质可用于组织工程。本视频中，通过脱细胞处理心包组织，制备出无细胞的细胞外基质凝胶。随后对细胞外基质进行处理，以制备成可溶性的液态形式。接下来，在小型动物模型中测试该可溶性基质，以评估其作为可注射支架的可行性。组织学和免疫组织化学分析表明，在体内，注射后的材料可形成多孔纤维状支架，允许血管细胞浸润。大家好，我叫 Sonia Zeki。我是加州大学圣地亚哥分校 Karen Chrisman 博士实验室的一名研究生。今天我们将从脱细胞组织中制备可溶性细胞外基质（ECM），并演示其在心脏组织工程应用中的体内测试。这些技术对于开发用于治疗心力衰竭的可注射生物材料疗法至关重要。在心肌梗死后，由本实验室的兽医神经外科医生 Pam Shoot McGuffin 演示手术过程。现在我们开始吧。首先对组织进行脱细胞处理，以保留细胞外基质（ECM）。将猪心包组织置于盛有去离子水的烧杯中，在室温下搅拌清洗30分钟。清洗后，将组织放入含有1% SDS和1%青霉素-链霉素的1× PBS溶液中，在室温下持续搅拌24小时。次日，将组织重新放回去离子水中，持续搅拌5小时，并在50 mL试管中振荡，直至所有泡沫完全消失。血红素和伊红染色应显示脱细胞组织中细胞核的缺失。将剩余的脱细胞组织置于15至50毫升的锥形管中，然后将组织放入-80摄氏度的冰箱中。将冷冻样品在极低压力和极低温度下进行冷冻干燥，直至完全干燥。根据所用系统及样品含水量的不同，干燥过程可能需要12至72小时。一旦脱细胞组织完全干燥，将其转移至Wiley Minim研磨机中。使用40目筛网进行研磨，将组织研磨成细粉。当大部分样品通过滤网后，取下收集罐。此样品现称为细胞外基质或ECM粉末。此时可进行第二次冻干步骤，若不立即进行下一步操作。这一步骤可确保记录的重量准确，用于溶解细胞外基质（ECM）。将所需量的ECM粉末称重至无菌冻存管中。向含有 ECM 粉末的闪烁瓶中加入含每毫升一毫克的无菌过滤盐酸溶液 Pepcid，使 ECM 浓度达到每毫升 10 毫克。加入搅拌子，并将瓶子置于搅拌板上。持续搅拌 48 至 60 小时，期间使用无菌 WHE 勺子或刮刀定期刮下瓶壁上的残留物，以确保所有 ECM 粉末充分消化。随着 ECM 被消化，其将逐渐进入溶液。一旦细胞外基质（ECM）被溶解，立即将样品置于冰上，并使用氢氧化钠和盐酸调节pH至7.4。pH调节完成后，加入10倍浓度的PBS，使溶液的最终浓度为1倍PBS。例如，若含有900微升（µL）的ECM溶液，在调节pH后，应加入100微升（µL）的10倍PBS。通过计算用于中和的添加体积以及用于测试 pH 值的移除体积，确定溶解的细胞外基质（ECM）溶液的浓度。然后加入一倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS），以达到此处所需的终浓度：6 毫克/毫升。手术当天，用带有30号针头的0.1毫升注射器准备75微升溶解的细胞外基质（ECM）注射液。使用2.5%氟烷维持Harlan dolly雌性大鼠的麻醉状态。涂抹眼膏保护眼睛，然后通过夹捏脚趾确认麻醉效果。通过下腹部皮下注射给予3 mL乳酸林格液以补充水分。随后，将动物仰卧位放置于手术台上，并轻轻固定四肢。使用电推剪去除腹部毛发，并用吸尘器清理散落的毛发。从剑突至腹部右下侧沿对角线方向，进行一系列50 µL的2%利多卡因注射。然后使用聚维酮碘从腹中部开始向外周擦拭消毒三次。再用异丙醇重复擦拭消毒三次。然后使用带有预制圆形窗口的手术巾覆盖动物，并用手术巾固定。使用10号手术刀。从剑突开始，向腹部右下方做一条3至4厘米长的切口。找到剑突，沿肌肉向右垂直向下分离，注意避免损伤右侧的大血管。接着，使用剪刀横向剪开肌肉，暴露膈肌。使用一根36英寸长的3-0号薇乔缝线和一把止血钳时，需小心避免触碰肝脏。将一根针穿过剑突，并将缝线拉至一半穿过剑突。将缝线两端用胶带粘在一起，并固定在动物上方后方的某一点上，提起剑突，暴露膈肌，再使用另一根36英寸长的3-0号薇乔缝线完成操作。将针穿过靠近剑突的肌肉，再次拉过并固定到手术台右侧的另一位置，充分暴露手术腔隙。接着，使用一对小型鼠齿显微镊夹住膈肌中心，将其向外牵拉，并用钝头剪刀做一微小切口。一旦形成此孔洞，肺组织便会回缩。沿膈肌垂直做2至3厘米的切口，以暴露心脏。然后将一根3英寸的棉签插入胸腔左侧，并将肺组织推开。使用巾钳固定棉签位置。使用另一根棉签将右肺移开，以找到心包膜囊。然后使用一对微型镊子和一对大型锯齿状镊子，撕开心包膜囊，暴露心脏的心尖。用右侧带齿微型镊子夹住心尖，并将针头斜面向左插入，注射溶解的基质。从心尖向上三分之一处，平行于心外膜表面进针。注意避免损伤心脏大静脉。注射溶解后的基质凝胶，拔出针头前等待数秒钟。注射部位的组织应变白，用棉签擦去胸腔内的血液，使用弯头显微止血钳移除夹住右肺的止血钳和棉签，用一段30英寸长的5-0普理灵缝线打一个初始结。然后使用鼠齿显微镊子，配合带圆锥形针头的连续缝合线关闭膈肌，最后完全闭合。插入PE-160吸引管，并使用10毫升注射器抽吸胸腔以排出气体。收紧缝线时，膈肌应呈凹面。将氟烷的浓度调至1%。取出用于保持切口开放的两根3-0薇乔缝线。用棉签或无菌纱布擦去多余液体，使肌肉保持湿润。使用一段新的3-0缝线以间断缝合方式关闭肌层。随后关闭异氟烷气体。清洁手术区域，并使用缝钉关闭皮肤。然后在切口部位涂抹三联抗生素软膏。将大鼠置于100%氧气环境中使其恢复。当动物开始自主呼吸并绕过呼吸机时，拔除气管插管。当动物恢复站立后，皮下注射盐酸布托啡诺镇痛剂，剂量为每千克体重0.05毫克，并将其放回饲养笼中，笼内铺有无菌毛巾。注射可溶性基质凝胶的大鼠心脏组织在不同时间点取材后进行切片，并用苏木精、伊红（H&E）染色以进行大体组织学分析。术后早期时间点可见注射区域呈现粉红色的纤维网络结构，而在后期时间点则表现为间质性扩散。两周后可观察到细胞流入。可见注射基质的降解。若在注射前用生物素标记细胞外基质（ECM），则可通过辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉亲和素对生物素进行染色，更直接地观察基质注射区域内的血管长入及形成情况。此处的切片已用fitzy进行共染色。共轭选择素（显示为绿色）可结合内皮细胞，抗平滑肌肌动蛋白抗体（显示为红色）。干细胞也可能在注射区域附近被识别出来。此处通过C kit免疫组织化学染色对它们进行了可视化。观看本视频后，您应能够充分理解如何从脱细胞组织中制备可溶性细胞外基质，并在体内测试其用于心脏组织工程的应用。请注意，尽管我们使用心包组织，但该通用方案可经修改后用于任何来源的组织。感谢观看，祝您的实验顺利。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

心肌组织工程生物衍生的注射材料的制备

在此，我们演示了包含骨骼肌成肌细胞的胶原基组织工程构建物的制备方法。这些三维工程化构建物可用于组织的替代或修复 体内为实现这一目的，我们设计了房室电传导通路，用于完全性心脏传导阻滞的修复[1].

肌源性工程组织构建物的制备

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。...

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

为了构建高度有序的复杂组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个整体复合物。这种组合设计结合了器官特异性的分层细胞片，以及两种不同的生物来源材料，后者包含强韧的纤维基质基础和内皮细胞，以促进新生血管的形成。...

组织工程：构建用于递送分层细胞片的多细胞三维支架

本方案旨在通过使用水凝胶系统和基于纤维蛋白的胶水，克服干细胞治疗心肌梗死时细胞移植率低的局限性。采用该方法，可在心肌梗死后维持细胞与组织之间的接触，从而提高有益因子在损伤部位的治疗潜力。...

一种基于水凝胶支架和纤维蛋白胶的方法在小鼠心肌梗死模型中递送治疗药物

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

本方案描述了一种结合微加工技术与冷冻凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的方法。在载入细胞后，可形成三维微组织，且易于注射 在体内 以促进再生治疗，或组装成阵列用于 体外...

用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

本方案描述了在保留细胞外基质成分的同时，对人心肌组织进行完全脱细胞处理。对细胞外基质的进一步加工可制备出微颗粒及一种具有细胞保护作用的自组装水凝胶。...

人类心脏组织制备自组装细胞外基质水凝胶的处理方法 体外 和 体内 应用

本方案旨在生成含有源自人诱导性多能干细胞的心血管细胞的网状工程化心肌组织，以用于心脏疾病细胞移植治疗的研究。...

由人iPS细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

基于干细胞的治疗已成为修复心肌梗死后受损心肌组织的有效策略。我们提供了一种利用可被酶促交联的明胶水凝胶进行干细胞移植的最佳体内应用方法。...

小鼠心肌梗死模型中注射型水凝胶负载间充质干细胞的心肌内移植

利用干细胞衍生的心肌细胞生物工程构建的三维心脏组织已成为研究健康与疾病状态下人类心肌的有前景模型 体外...

设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

学习制备脱细胞心包组织基质凝胶的方法，用于心脏组织工程研究。该技术通过大鼠心肌内注射评估可注射支架的可行性，为心力衰竭治疗提供生物材料方案。

用于心肌组织工程的生物来源可注射材料的制备

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