研究胶质细胞异质性对轴突生长影响的新共培养方法

本实验的总体目标是研究胶质细胞异质性对背根神经节（DRG）轴突生长和细胞去极化的影响。首先，从新生大鼠大脑皮层中分离胶质细胞以实现该目标。实验的第二步是培养并纯化大鼠胚胎背根神经节（DRG）神经元。

该实验步骤的第三步是将纯化的背根神经节（DRG）神经元添加到胶质细胞上。实验步骤的最后一步是观察细胞轴突的外显子生长，并进行细胞染色和定量分析。最终可获得实验结果。

通过延时记录和免疫荧光显微镜观察，该实验表明背根神经节神经元的生长受到异质性胶质细胞的影响。大家好，我来自加州大学河滨分校神经病学系的神经影像实验室。今天我们将向您展示一种新的体外培养方法，用于研究胶质细胞对神经元生长的异源性影响。

在我们的实验室中，我们采用这种新方法研究神经元与胶质细胞之间的相互作用。现在开始进行实验研究。为了建立胶质细胞与背根神经节神经元（DRG）的共培养体系，我们首先在组织培养罩内进行胶质细胞的培养：将已预先灭菌的24孔培养板底部铺上无菌圆形玻璃盖玻片，然后将这些盖玻片置于6孔培养板的孔中，用多聚赖氨酸包被，并在室温下孵育2小时。

用蒸馏水将盖玻片和培养板清洗两次，然后自然晾干。随后，分别向每个24孔板或6孔板中加入200微升或2毫升含10%胎牛血清（FBS）的DCO2修饰的伊格尔培养基（DMEM）。次日，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育培养板。

对正压流解剖罩进行灭菌。打开紫外灯照射20分钟，然后用70%乙醇喷洒罩内所有表面，静置15分钟后方可使用。取两至六日龄、通过低温麻醉的两隻大鼠幼崽头部开始实验。

然后用手术剪在枕骨大孔基底部剪断头部。使用虹膜剪沿矢状缝切开颅骨，并剥离颅骨。取出前脑，放入预冷的Leibovitz L-15培养基中，并对第二个头部重复上述操作。

然后在体视显微镜下操作，小心去除覆盖在脑组织上的硬脑膜、软脑膜以及血管，分离出皮层，并用 L-15 培养基多次洗涤。

使用显微手术剪将皮层切成小块。然后在含有0.125%胰蛋白酶和EDTA的L-15培养基中，37摄氏度孵育15分钟。接着，将组织块转移至含有20毫升含20%胎牛血清（FBS）的DMEM的50毫升离心管中。

加入DS，使其终浓度为10微克/毫升。然后使用火焰抛光的巴斯德吸管轻轻吹打组织悬液约20次，以分离细胞。最后用含10% FBS的DMEM洗涤细胞一次，并用血细胞计数板测定细胞数量。

然后以每平方厘米5,000至10,000个细胞的密度接种细胞，并在37°C和5%二氧化碳条件下培养。每周更换两次培养基，以分离、纯化和培养背根神经节（DRGs）。首先，按照之前的方法准备24孔板，孔内放置经多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片。

向每个盖玻片中加入 100 微升 NVF 培养基，于次日在 37 摄氏度条件下孵育培养板。按之前方法对正压流超净台进行灭菌。随后，在体视显微镜下，从经二氧化碳安乐死的妊娠大鼠子宫中分离出 E12 至 E15 大鼠胚胎并开始操作。

分离带有相连背根神经节的脊髓，并转移至含有冷的Leibovitz L-15培养基的35毫米培养皿中。使用显微外科镊子，在不损伤背根神经节的前提下，从脊髓上小心解剖分离相连的背根神经节，并在冷的L-15培养基中切断相连的轴突。

通常，当从一条脊髓中分离出全部背根神经节（DRG）时，可获得20至30个DRG。将所有分离的DRG置于含0.125%胰蛋白酶和EDTA的溶液中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育20分钟，然后用含20%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基洗涤细胞一次，接着加入DNA酶，并使用火焰抛光的巴斯德移液管反复吹打数次，以形成均匀的细胞悬液（如胶质细胞处理所示）。再用MBF培养基进行第二次洗涤，计数细胞后，将细胞以每孔5,000个的密度接种至24孔板中预先准备好的盖玻片上，过夜孵育以纯化背根神经节神经元。

接种后18至24小时。72小时后，更换为含有20 µM 5-氟-2-脱氧尿苷的Neurobasal培养基。之后每次更换一半培养基，使用不含FUDR的Neurobasal培养基。

每隔一天更换一次培养基。胶质细胞接种后约20天，将生长至融合状态，并在与神经元共培养前24小时准备好两种细胞类型。

将胶质细胞培养基更换为MBF培养基。按照先前所述方法制备纯化的背根神经节（DRGs）单细胞悬液。测定细胞密度。

然后将神经元以每平方厘米500个细胞的密度接种到胶质细胞上。可使用图像分析软件和针对特定细胞类型的免疫化学方法，在不同时间点分析神经元存活及胶质细胞上的神经突生长情况。以下是胶质细胞和背根神经节（DRG）神经元分别培养以及共培养的示例：共培养20天后，胶质细胞达到汇合状态。

在培养过程中，通过相差显微镜观察发现，不同胶质细胞亚群形成 distinct 的生长模式和形态。并通过免疫细胞化学证实，GFAP 阳性的星形胶质细胞占培养细胞总数的 90% 以上。

采用我们使用氟尿苷（FUDR）处理72小时的方法，背根神经节（DRG）神经元的纯度在六天内可高达99%，并在神经元与胶质细胞的共培养体系中表现出其独特的形态特征，神经突生长密集。在接种后四小时内，DRG神经元即可在胶质细胞上迅速贴附并启动神经突生长；而神经元的贴附与神经突延伸过程受到胶质细胞亚群的影响，形成可在相差显微镜下清晰识别的特定生长模式亚结构。接下来，我将通过免疫细胞化学方法，向您展示如何将DRG神经元与不同类型的胶质细胞共培养，以研究胶质细胞异质性对神经突生长的影响。

进行本实验操作时，非常重要的一点是必须轻柔处理组织，并始终将细胞置于培养基中。切勿将其暴露于空气中，以免细胞干燥。就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。