Name: 研究胶质细胞轴突的生长异质性的影响，使用一个新的共培养法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 了解胶质细胞异质性对轴突生长的影响，使用大鼠皮层胶质细胞与背根神经节神经元的新型共培养方法。该技术通过体外模型研究神经发育机制，为神经生物学研究提供可靠工具。

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本研究由FMMU新发现基金会和部分NIH资助支持。

1. 胶质细胞培养
可从中枢神经系统的不同区域培养胶质细胞。整个过程如流程图所示。
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="胶质细胞-背根神经节共培养示意图：显示细胞分离、消化及神经元生长影响过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="过程 1">
第1天 包被培养板和盖玻片
<ol>
	<li>将已灭菌的玻璃显微镜圆形盖玻片在高压灭菌器中干燥。</li>
	<li>将灭菌后的盖玻片放入已灭菌的24孔细胞培养板中。</li>
	<li>用多聚赖氨酸包被盖玻片，并在室温下孵育2小时。</li>
	<li>以与步骤3相同的方式包被6孔细胞培养板。</li>
	<li>用蒸馏水清洗盖玻片和6孔培养板各两次，并在生物安全柜中自然晾干。</li>
	<li>在24孔板的每孔中加入200 μL DMEM培养基（含10% FBS），在6孔板的每孔中加入2 mL，然后将培养板放入37°C、5% CO2的培养箱中。</li>
</ol>
第2天 分离皮层及胶质细胞培养
<ol>
	<li>对正压流解剖罩进行灭菌。</li>
	<li>开启紫外灯照射 20 分钟。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒所有表面，作用15分钟后使用。</li>
	<li>通过低温麻醉大鼠幼崽（P2-P6），然后使用手术剪在枕骨大孔基部进行断头。</li>
	<li>使用虹膜剪沿矢状缝切开颅骨，并剥离颅骨。</li>
	<li>在体视显微镜下，取出前脑并置于预冷的L15培养基中，仔细清除带有血管的硬脑膜和软脑膜，分离皮层，并用L15培养基反复洗涤数次。</li>
	<li>用显微手术剪将皮层切成小块。</li>
	<li>将用L15培养基配制的0.125%胰蛋白酶-EDTA加入皮质组织块中，37摄氏度孵育15分钟。</li>
	<li>将组织块转移至含有20% FBS的20 mL DMEM培养基中，置于50 mL离心管内，加入DNase储备液至终浓度为10 μg/mL，用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管反复吹打组织悬液20次，收集单细胞悬液。</li>
	<li>用DMEM培养基将细胞悬液洗涤一次，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM重悬细胞，在显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数，以每平方厘米5000–10000个细胞的密度接种细胞2在37°C、5% CO₂培养箱中培养细胞，每周更换两次培养基，每次更换一半。</li>
</ol>
2. 背根神经节神经元的分离、培养与纯化
第1天 准备培养材料
<ol>
	<li>将灭菌的盖玻片用多聚赖氨酸包被，用蒸馏水洗涤盖玻片两次，室温晾干后放入24孔板中。</li>
	<li>每孔加入100μL含2% B27和2.5S NGF（50 ng/mL）的Neurobasal培养基，将培养板置于37°C、5% CO2培养箱中。</li>
</ol>
第2天 从胚胎中分离背根神经节
<ol>
	<li>按照胶质细胞培养的方法对超净工作台进行灭菌。</li>
	<li>用过量 CO2 处死一只妊娠大鼠（E15），以 70% 乙醇消毒腹部，从子宫中分离胚胎并放入预冷的 L15 培养基中。</li>
	<li>在体视显微镜下分离带有连接的背根神经节的脊髓，并转移至含有预冷 L15 培养基的 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>收集单细胞悬液，并用 NBF 培养基（含 2% B27 和 2.5S NGF（50 ng/mL）的 Neurobasal 培养基）洗涤一次。</li>
</ol>
第3天 纯化背根神经节神经元
<ol>
	<li>神经元接种后18-24小时，向神经元培养物中加入1 mM的FUDR储备液，使其终浓度为20 μM，终体积为200 μL。</li>
	<li>72小时后，更换一半培养基，加入含有2% B27和2.5S NGF（50 ng/mL）但不含FUDR的Neurobasal培养基。此后每隔一天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 将背根神经节神经元与胶质细胞共培养
<ol>
 <li>当胶质细胞培养达到汇合状态（接种后约20天），即可用于与神经元的共培养。</li>
	<li>在加入纯化神经元前24小时，将胶质细胞的培养基更换为含2% B27和2.5S NGF（50 ng/mL）的Neurobasal培养基。</li>
	<li>从培养孔中收集纯化的神经元，通过火焰抛光的巴斯德移液管进行机械吹打，获得单细胞悬液。</li>
	<li>计数后，将神经元以500/cm2的密度接种至含2% B27和2.5S NGF（50 ng/mL）的Neurobasal培养基中的汇合胶质细胞层上。</li>
	<li>可通过图像分析软件及使用细胞类型特异性抗体的免疫细胞化学方法，在不同时间点记录并分析神经元在胶质细胞上的黏附情况及神经突的生长。</li>
</ol>
4. 代表性结果
<ol>
	<li>胶质细胞培养： 接种后，胶质细胞约20天达到融合状态。在相差显微镜下可清晰观察到不同形态的胶质细胞亚群形成不同的生长模式亚结构，免疫细胞化学技术显示GFAP阳性星形胶质细胞占比超过90%（图1，图2）。</li>
	<li>背根神经节（DRG）神经元培养： 在本方法中，经过72小时FUDR处理后，6天内DRG神经元纯度可达99%。DRG神经元表现出其独特的形态特征，并具有高密度的神经突生长（图3，图4）。</li>
	<li>胶质细胞与神经元共培养： DRG神经元接种后4小时内即可在胶质细胞层上迅速黏附并开始神经突延伸。仔细观察发现，神经元的黏附和神经突生长受到形成特定生长模式亚结构的胶质细胞亚群的影响，该现象可通过相差显微镜和免疫细胞化学方法清晰识别（图5，图6）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="用于组织研究与分析的成纤维细胞培养显微图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 汇合胶质细胞的形态学特征。 将皮层胶质细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，培养20天后观察其不同的生长模式；注意左侧细胞呈放射状排列。
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="显示红色染色纤维的神经组织显微图像，用于细胞结构研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 由胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体标记的融合胶质细胞。 注意右侧 GFAP（红色）阳性细胞呈放射状排列。
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="显微镜下真菌孢子萌发，显示丝状菌丝生长连接。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 背根神经节神经元的生长 体外 未经过 FUDR 处理。 污染细胞构成了背根神经节神经元的背景。
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="细胞培养显微图像，显示成纤维细胞，适用于细胞生长和形态学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 背根神经节神经元生长 体外 经FUDR处理后。 背景污染细胞已被完全清除。
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="显微镜下的细胞培养；生物学研究中的细胞生长模式。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. 在胶质细胞上培养的背根神经节神经元。 神经元的黏附和神经突生长在呈放射状排列的细胞上受到抑制，在右侧胶质细胞上生长受限。
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="用于神经网络研究的神经元荧光显微图像，显示细胞核和树突。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 图6. 背根神经节神经元在胶质细胞上生长，胶质细胞经神经丝蛋白抗体标记。 神经突（绿色）在辐射状排列的左侧胶质细胞上受到抑制，而在右侧胶质细胞上生长受限，所有胶质细胞均经GFAP抗体（红色）标记。

<ol><li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+time+to+move%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: time to move?</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li>
<li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li>
<li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Culturing+nerve+cells%22%5BJournal%5D)">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本实验方案旨在实现两个目标，以研究胶质细胞，特别是星形胶质细胞异质性对神经元黏附和神经突生长的影响。第一个目标是尽可能保持星形胶质细胞的异质性。在本实验中，汇合的富含星形胶质细胞的胶质细胞培养物为未经任何化学处理和消化传代的混合原代培养，以避免对细胞造成进一步损伤并诱导星形胶质细胞的损伤反应。最终星形胶质细胞纯度超过90% GFAP阳性，成纤维细胞污染少于1%，经成纤维细胞FN验证。初始接种密度较低，使细胞在达到汇合前经历多轮分裂。在相差显微镜下，可通过不同形态的星形胶质细胞形成的多种亚结构观察到胶质细胞的异质性。第二个目标是获得高纯度的背根神经节（DRG）神经元，并将其与胶质细胞共培养，以研究异质性对神经元行为的影响。背根神经节中存在的污染细胞（如成纤维细胞和施万细胞）在培养条件下会显著影响或改变轴突生长5, 6。为避免这种非预期的影响，DRG神经元在无血清培养基中培养，并用氟脱氧尿苷（FUDR）处理72小时，以清除所有其他类型的细胞。经此处理后，DRG神经元纯度可达99%，比传统方法更为高效，后者需多次处理神经元培养物7。通过相差显微镜结合延时成像和图像分析方法，可方便地对单个DRG神经元...

<table><tbody><tr><td>DMEM（高糖）</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>L15 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11415-114</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>多聚赖氨酸（poly-lysine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>细胞培养级</td></tr><tr><td>神经生长因子（NGF, 2.5S）</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>氟脱氧尿苷（FUDR）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>神经丝蛋白抗体（neurofilament antibody）</td><td>Abcam</td><td>ab24575</td><td></td></tr></tbody></table>

研究胶质细胞异质性对轴突生长影响的新共培养方法

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

在所有哺乳动物的中枢神经系统中，损伤后断裂的轴突无法再生至其原始靶点，功能恢复非常有限1。轴突再生失败是多种因素共同作用的结果，包括不利的胶质细胞环境、抑制性髓鞘相关分子以及神经元自身再生能力的下降2。星形胶质细胞是中枢神经系统中最主要的胶质细胞类型，在生理和病理条件下对轴突功能具有重要作用3。与同源的少突胶质细胞不同，星形胶质细胞是一类异质性细胞群体，由多种具有不同形态和基因表达特征的星形胶质细胞亚群组成4。这种异质性的功能意义，例如其对轴突生长的影响，目前仍 largely 未知。
为了研究胶质细胞，特别是星形胶质细胞异质性在神经元行为中的功能，我们建立了一种新方法，即将高度纯化的背根神经节神经元与来自大鼠皮层的胶质细胞进行共培养。通过该技术，我们能够在相同条件下直接比较不同星形胶质细胞亚群上神经元的黏附和轴突生长情况。
在本报告中，我们提供了星形胶质细胞分离与培养、背根神经节神经元的分离与纯化，以及背根神经节神经元与星形胶质细胞共培养的详细实验方案。该方法也可拓展至其他脑区，用于研究神经元与胶质细胞之间的细胞或区域特异性相互作用。

在本方案中，我们描述了一种研究胶质细胞异质性对轴突生长影响的新方法 体外 共培养系统。将大鼠皮层胶质细胞培养至汇合后，与高度纯化的大鼠背根神经节神经元进行共培养。在同一培养体系中直接比较不同胶质细胞对神经元黏附和轴突生长的影响。该方法为直接研究胶质细胞异质性对神经元黏附和轴突生长的影响提供了新途径。

在所有哺乳动物的中枢神经系统中，受伤后断裂的轴突无法再生至其原始靶点，因而功能恢复难以实现……

本实验的总体目标是研究胶质细胞异质性对背根神经节（DRG）轴突生长和细胞去极化的影响。首先，从新生大鼠大脑皮层中分离胶质细胞以实现该目标。实验的第二步是培养并纯化大鼠胚胎背根神经节（DRG）神经元。该实验步骤的第三步是将纯化的背根神经节（DRG）神经元添加到胶质细胞上。实验步骤的最后一步是观察细胞轴突的外显子生长，并进行细胞染色和定量分析。最终可获得实验结果。通过延时记录和免疫荧光显微镜观察，该实验表明背根神经节神经元的生长受到异质性胶质细胞的影响。大家好，我来自加州大学河滨分校神经病学系的神经影像实验室。今天我们将向您展示一种新的体外培养方法，用于研究胶质细胞对神经元生长的异源性影响。在我们的实验室中，我们采用这种新方法研究神经元与胶质细胞之间的相互作用。现在开始进行实验研究。为了建立胶质细胞与背根神经节神经元（DRG）的共培养体系，我们首先在组织培养罩内进行胶质细胞的培养：将已预先灭菌的24孔培养板底部铺上无菌圆形玻璃盖玻片，然后将这些盖玻片置于6孔培养板的孔中，用多聚赖氨酸包被，并在室温下孵育2小时。用蒸馏水将盖玻片和培养板清洗两次，然后自然晾干。随后，分别向每个24孔板或6孔板中加入200微升或2毫升含10%胎牛血清（FBS）的DCO2修饰的伊格尔培养基（DMEM）。次日，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育培养板。对正压流解剖罩进行灭菌。打开紫外灯照射20分钟，然后用70%乙醇喷洒罩内所有表面，静置15分钟后方可使用。取两至六日龄、通过低温麻醉的两隻大鼠幼崽头部开始实验。然后用手术剪在枕骨大孔基底部剪断头部。使用虹膜剪沿矢状缝切开颅骨，并剥离颅骨。取出前脑，放入预冷的Leibovitz L-15培养基中，并对第二个头部重复上述操作。然后在体视显微镜下操作，小心去除覆盖在脑组织上的硬脑膜、软脑膜以及血管，分离出皮层，并用 L-15 培养基多次洗涤。使用显微手术剪将皮层切成小块。然后在含有0.125%胰蛋白酶和EDTA的L-15培养基中，37摄氏度孵育15分钟。接着，将组织块转移至含有20毫升含20%胎牛血清（FBS）的DMEM的50毫升离心管中。加入DS，使其终浓度为10微克/毫升。然后使用火焰抛光的巴斯德吸管轻轻吹打组织悬液约20次，以分离细胞。最后用含10% FBS的DMEM洗涤细胞一次，并用血细胞计数板测定细胞数量。然后以每平方厘米5,000至10,000个细胞的密度接种细胞，并在37°C和5%二氧化碳条件下培养。每周更换两次培养基，以分离、纯化和培养背根神经节（DRGs）。首先，按照之前的方法准备24孔板，孔内放置经多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片。向每个盖玻片中加入 100 微升 NVF 培养基，于次日在 37 摄氏度条件下孵育培养板。按之前方法对正压流超净台进行灭菌。随后，在体视显微镜下，从经二氧化碳安乐死的妊娠大鼠子宫中分离出 E12 至 E1

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神经科学

研究胶质细胞轴突的生长异质性的影响，使用一个新的共培养法

我们开发了一种新型的多区室神经元共培养微系统平台，用于体外研究中枢神经系统中轴突与胶质细胞的相互作用。该平台能够并行开展多达六项独立实验，并采用新开发的宏/微混合制造方法加工而成。...

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基于微流控培养平台（MCP）的神经元轴突与胶质细胞共培养系统中神经元-胶质细胞相互作用的成像分析

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本方案描述了用于区室化分析神经元-胶质细胞相互作用的间接神经元-星形胶质细胞共培养方法。...

间接神经元-星形胶质细胞共培养实验：一种 体外 神经元-胶质细胞相互作用精细研究的实验装置

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

本文介绍了一种用于实时研究人胶质瘤细胞（hGC）迁移的离体混合单层培养系统。该模型能够在分隔式培养腔内观察hGCs与有髓鞘及无髓鞘轴突之间的相互作用。...

在背根神经节轴突-少突胶质细胞共培养体系中实时监测人胶质瘤细胞迁移

本文介绍一种利用特定培养基的简单方法，可从胚胎皮层高效且可重复地建立富含神经元和星形胶质细胞的培养物，或神经元-胶质细胞共培养物。...

一种用于研究缺血过程中神经元-胶质细胞相互作用的细胞培养模型

我们提出一种体外模型，用于评估嗅鞘施万细胞（OEG）在神经损伤后的神经再生能力。该模型基于将成年视网膜神经节细胞（RGN）的轴突切断后，与OEG单层细胞共培养，并通过分析RGN轴突及胞体-树突标志物，进而研究轴突再生情况。...

轴突切断的大鼠视网膜神经节细胞与嗅鞘施万细胞共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型

本文介绍了一种易于使用的共培养实验方法，用于分析胶质母细胞瘤（GBM）细胞在图案化神经元上的迁移。我们开发了一个FiJi软件宏，可简便地定量GBM细胞在神经元上的迁移，观察到神经元可改变GBM细胞的侵袭能力。...

在图案化神经元上共培养胶质母细胞瘤干细胞样细胞以研究迁移和细胞相互作用

了解胶质细胞异质性对轴突生长的影响，使用大鼠皮层胶质细胞与背根神经节神经元的新型共培养方法。该技术通过体外模型研究神经发育机制，为神经生物学研究提供可靠工具。

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