活体物种氧分布的电子自旋共振显微成像

以下实验的总体目标是通过电子自旋共振（ESR）显微技术，获取活细胞周围微米级、三维的氧气浓度图像。本方案将以常见的光合细胞——蓝细菌为例进行演示。首先，将蓝细菌样品制备于ESR显微镜的样品 holder 中，以实现该目标。

将样品置于稳定的有机自由基溶液中。样品架被放入电子自旋共振（ESR）显微系统的成像探头内，再插入ESR显微系统的静态电磁铁中。随后，利用ESR显微镜获取该有机自由基溶液的多幅三维ESR显微图像。

该操作针对多种脉冲序列变体进行，并且通常在不同外部条件下（如光照和黑暗条件）下进行。接下来，计算机对原始数据图像进行处理，以提取自由基的三维空间分辨弛豫时间。这些弛豫时间通过预先建立的校准曲线，可直接反映氧气浓度，从而获得在不同外部条件下测量样品的完整三维氧气分布图。

实验结果清楚地表明，当无光照时，蓝细菌无法产生氧气。此外，结果还显示，在光照条件下，蓝细菌细胞附近会形成显著的氧气梯度和氧气分布不均现象。大家好，我是来自以色列海法理工学院化学学院BLA实验室的al。

今天，我们将向您展示一种利用荧光寿命显微镜以高空间分辨率在三维空间中绘制生命细胞附近氧浓度分布的方法。我们在实验室中使用该方法来研究细胞的耗氧速率和代谢活性。现在，让我们开始吧。

电子自旋共振（ESR）是一种光谱技术，其原理是在外加静态磁场中，具有未成对电子自旋的顺磁性物质会吸收特定频率的电磁辐射。该方法可用于研究活体物种中顺磁性分子所处的环境，包括氧气和活性氧物种的浓度。下图展示了一只荷瘤小鼠的典型氧浓度成像结果，适用于异质性样品。

通过使用磁场梯度，可以以空间分辨的方式获得电子自旋共振（ESR）谱信息。将一种稳定的有机自由基注入小鼠体内，其ESR特性可提供该自由基所处环境中的氧浓度。基于ESR的结果被叠加在磁共振成像（MRI）解剖图像上。

迄今为止，对活体样本的此类电子自旋共振（ESR）成像技术仅在毫米尺度的相对较大样本上实现。分辨率更高的ESR显微技术则涉及对毫米及亚毫米尺寸样本的测量，可提供接近一微米分辨率的三维ESR图像。

以下是高分辨率微米尺度电子自旋共振（ESR）的两个示例图像，样品中包含NNC 60粉末和锂铁氰化物顺磁性晶体。ESR显微镜与传统的ESR波谱仪类似，包含用于产生静态磁场的磁体、用于自旋激发和信号检测的微波系统、用于固定样品的探头，以及用于控制数据采集过程和数据处理的计算机控制台。该系统的其他组件包括磁场梯度驱动器（属于电子系统的一部分）和位于成像探头内的梯度线圈。

梯度线圈还设有通光孔径，以便对样品进行光照。实验过程中需向样品施加受控温度的湿润空气，以确保样品脱水程度最小。电子自旋共振（ESR）显微镜的主要独特之处在于探头和梯度线圈的尺寸较小、系统具有更高的自旋灵敏度，以及磁场梯度驱动器具有高强度。在开始本实验步骤之前，需制备浓度为40毫克/毫升的蓝细菌悬浮液。

开始电子自旋共振显微成像样品制备时，使用精细镊子取几块尺寸约为400 × 400微米的吸水纸。然后将其插入埃诺尔管中。随后向管中加入1.2 mL的蓝细菌悬液。

然后将悬液在微型离心机中以6,000 RPM离心2分钟。离心后，除保留约50微升以避免蓝细菌脱水外，其余上清液完全移除。此过程可使吸水纸充分吸附蓝细菌细胞。接下来，准备一个特制的杯状玻璃样品 holder，用精细镊子从纸上提取少量纤维，并将其置于样品 holder 的底部。

随后，加入三毫摩尔的三氯乙醛和BG 11溶液，该溶液按照书面实验方案中的描述，通过八号注射器制备。然后，在玻璃样品架边缘与其匹配的盖玻片之间涂抹紫外光固化胶，并留出一个小的通气口，以密封样品架。最后，用紫外光照射两秒钟以固化胶水。

开始成像实验时，打开电子自旋共振（ESR）显微成像系统，并将样品插入位于成像探头内部的谐振器中。接着使用计算机控制软件，将系统设置为调谐模式，找到探头的共振微波频率，该频率将用于后续的ESR测量。随后，将静态磁场设定为与所施加的微波频率相匹配的数值。

设置脉冲序列的时序参数，并观察ESR信号，以确保系统功能正常且样品制备良好。然后将成像参数（如像素数量、梯度强度以及梯度脉冲持续时间）设置为所需值。完成设置后，采用汉恩回波成像脉冲序列，分别在脉冲间隔τ为500、600和700纳秒的条件下，采集三组三维ESR图像。

此时，如果实验条件需要，可在整个数据采集过程中打开样品的光照投影，数据将自动保存。数据采集完成后，通过 MATLAB 软件脚本处理原始数据文件。使用该软件生成三线态自由基浓度和弛豫时间的图像。

然后，通过已有的校准曲线将这些图像映射并转换为氧浓度图像，该校准曲线将氧浓度与弛豫时间相关联。其中，T₂₀ 是探针在无氧条件下的自旋-自旋弛豫时间，其值取决于探针的浓度 C 及其扩散系数 D。图中展示了在蓝细菌上进行的多个三维电子自旋共振（ESR）成像实验所获得的典型原始数据图像。这些图像在黑暗或光照条件下，采用不同的 τ 值采集得到。

在黑暗条件下，结果非常相似，但由于自旋-自旋弛豫时间 T₂ 的影响，较大的 T 值对应的信号强度有所降低。相反，在光照条件下，由于样品中不同区域的弛豫时间存在差异，图像模式发生变化。随后对这些数据进行处理，以从该图像中获得一幅振幅图像。

显然，蓝细菌主要位于样品 holder 的右侧。这两幅图像通过预先建立的校准曲线转换为氧气浓度值，该校准曲线将氧气浓度与弛豫时间关联起来。结果显示了在有光和无光条件下蓝细菌的氧气浓度情况。

显然，氧气的产生由光照引发，并导致溶液中氧气浓度显著升高。这会引起自由基T2的减少，主要发生在含有蓝细菌的吸水纸纤维附近的体素中。我们刚刚向您展示了如何制备含有活细胞及稳定自由基的样品，以通过电子顺磁共振（EPR）显微技术对氧气浓度进行成像分析。在进行该操作时，重要的是要尽量缩短操作时间，以确保可重复性，并避免样品失活。

以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。