通过灌胃法口服给予鱼藤酮及肠道神经系统中α-突触核蛋白包涵体的图像分析

帕金森病的症状，包括运动功能障碍和言语功能障碍，是由于大脑中分泌多巴胺的细胞活性降低所致。肠神经系统和嗅球是暴露程度最高的神经结构，也是最先受累的部位。帕金森病已被发现与农药暴露相关。

为了分析农药对肠神经系统的影响，通过口服灌胃法将农药 roone 施用于小鼠。随后对小鼠进行心内灌注4%多聚甲醛，以固定脑组织和肠神经系统。组织被取出后进行制备，并对帕金森病相关蛋白进行免疫染色。

通过共聚焦显微镜获得的 βIII 微管蛋白和 α-突触核蛋白图像显示，在接触农药的动物中，α-突触核蛋白在肠神经系统神经元内发生聚集。与现有的方法（如全身给予鱼藤酮）相比，该技术的主要优势在于能够确保鱼藤酮的作用局限于肠神经系统。该方法有助于回答帕金森病领域的一些关键科学问题，例如其病因以及疾病进展背后的分子机制。

该技术的应用拓展了帕金森病的治疗与诊断领域，因为它将有助于开发新的治疗靶点和诊断方法。尽管该方法可为帕金森病的病理生理学研究提供深入见解，还可应用于其他系统，例如研究其他环境毒素对肠神经系统、交感神经和副交感神经系统以及肠壁的影响。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到一定困难，因为掌握灌胃技术需要一定时间的学习和练习。

当我读到关于农药与帕金森病之间关联的研究时，首次产生了这些方法的想法。2005年在柏林举行的世界帕金森病大会上看到高水平的CORAs会议也提供了很大帮助。对此方法进行平和的示范是必要的。

使用灌胃法给予油酸（ol）较为困难，因为小鼠的解剖结构与人类不同；另一方面，这些图像的图像分析采用了定制化的步骤。开始实验前，首先称量动物体重，然后计算所需鱼藤酮的适当体积。

每克动物体重需要 0.01 毫升，相当于每千克体重五毫克的 roone 剂量。用 roone 溶液填充一支一毫升注射器，然后用溶剂溶液填充第二支注射器。抓起小鼠，用一只手握住小鼠的尾巴。

用另一只手的前两个手指拉伸颈部皮肤。将头部固定在两指之间后，将其靠在手掌上并倒置。固定尾部。

用小指和无名指固定头部使其向后仰，按压腭部以打开小鼠口腔。轻柔地将灌胃针插入小鼠口中，沿胃的方向缓慢推进，直至完全插入。

为避免物质进入肺部，应通过轻柔按压内栓缓慢给予罗恩溶液或溶剂。操作完成后，缓慢抽出灌胃针，将动物放回另一个笼子中，直至同一笼中的所有动物均完成处理。处理结束后，小鼠经心内灌注4%多聚甲醛进行灌流。

在 PBS 中，通过解剖取出肠道并置于 15% 蔗糖溶液中过夜。次日，将组织转移至 30% 蔗糖溶液中，在 4°C 下再次孵育过夜。随后将组织放入 -80°C 超低温冰箱中保存备用。使用冷冻切片机切取 20 微米厚的肠组织切片。

将横切面转移至载玻片，进行封闭和免疫染色操作。随后使用抗 beta three tubulin 和抗 alpha synuclein 抗体进行孵育。建议由外部人员对数据进行盲法分析。

开始分析时，打开 Fiji 软件，载入共聚焦图像文件，然后拆分通道，以便能够独立地对每个通道进行操作。

关闭所有不使用的通道，选择并分析图像，设置并调整比例，将像素大小设为1。将已知距离设为0.13，然后点击全局。此时图像的尺寸将以微米显示。

选择α-突触核蛋白通道并选择神经节。确保在所有切片中选择范围完全包围神经节。复制仅包含所选神经节的图像，此时仅神经节大小的图像将被复制。

按下编辑清除，选定区域以外的图像部分将变为黑色。再次复制图像以评估操作效果。信噪比较低的图像不应用于图像分析。

选择图像并调整阈值，然后选择最大熵。接着在裁剪后的图像和原始图像的切片上移动，以确保操作过程正确无误。

阈值选择基于图像直方图选取一个强度信号水平，只有强度高于此阈值的像素才会在黑白图像中以白色显示。然后点击“平滑”按钮。此步骤将图像的像素化边缘转换为平滑边缘。

然后点击二值化并选择“生成二值图像”。图像将显示为黑白图像。为在复制的图像上执行下一步操作，请点击分析，选择分析颗粒。然后勾选显示轮廓，并点击汇总。

其余设置应保持默认。该功能可识别出具有信号的像素总数以及聚集在一起的带信号像素的总面积，同时报告像素群组的数量及平均大小。

比较并选择总面积最大且贴合良好的切片。该切片将被标记。复制包含总α-突触核蛋白表面、包涵体数量和平均颗粒大小的数据表。

将数据粘贴到 Excel 电子表格中或在其他位置进行标注。返回 Fiji。在 β-tubulin 通道中找到先前选定的切片并选中它。

选择神经节区域，然后点击分析。接着选择测量。将出现另一个表格，显示神经节的总面积。

将表格中的数据提取到 Excel 电子表格中，靠近 α-突触核蛋白测量值的位置，或在其他位置使用 Excel 进行复制。将 α-突触核蛋白测量中获得的不同参数除以神经节表面积，以获得经神经节大小归一化的总 α-突触核蛋白表面值和包涵体数量，从而分析罗丹宁对肠神经系统局部作用的影响。通过口服灌胃向 1 年龄的 C57BL/6 小鼠给予 5 毫克/千克的杀虫剂罗丹宁。此处所示色谱图显示了给药后 1 小时对照小鼠中罗丹宁峰的存在情况，对照小鼠分别接受了 20 毫克/千克和 5 毫克/千克罗丹宁处理。

通过高效液相色谱法（HPLC）测定血液、脑组织及脑干提取物中的鱼藤酮水平，结果如图所示。以5毫克/千克剂量经口灌胃给予鱼藤酮后，在给药后1小时、2小时及3小时时，通过HPLC均未检测到血液中存在可测得的鱼藤酮水平。该图显示了经处理小鼠脑组织和脑干中的鱼藤酮含量。

给予每千克体重10毫克或更低剂量的鱼藤酮一小时后，脑或脑干样本中均未检测到鱼藤酮水平。给予1.5个月治疗小鼠一小时后，检测其肌肉和脑样本中线粒体复合物I的活性。各组之间无显著差异，表明线粒体复合物I未受抑制，从而证实这些区域不存在鱼藤酮。

在给予rone后，对帕金森病路易体成分α-突触核蛋白进行分析，可可靠地确定α-突触核蛋白的总表面含量、α-突触核蛋白包涵体的存在情况以及细胞内α-突触核蛋白的分布模式。该图显示了十二指肠和回肠切片中抗βIII微管蛋白、α-突触核蛋白及DAPI染色结果，如图所示。与对照组相比，1.5个月的roach处理在肠神经系统神经节内诱导出更明显的α-突触核蛋白点状分布模式，即使与3个月对照组相比亦如此。

该模式在回肠和十二指肠中均可观察到。经过三个月的治疗后，通过使用抗α-突触核蛋白、theof、黄素和DPI进行免疫荧光染色，可观察到较大的α-突触核蛋白包涵体的形成，且仅在三个月时显示出较大α-突触核蛋白聚集体的聚集。本实验采用自动分割和基于熵值的阈值方法进行分析。

在左侧的图中，每根柱形代表神经节表面的总α-突触核蛋白与神经节表面之比。在右侧的图中，每根柱形代表所取神经节表面的α-突触核蛋白包涵体总数。这些数据共同表明，局部给予鱼藤酮可诱导肠神经系统神经节中α-突触核蛋白的磷酸化、积聚和聚集，并伴有胶质增生。一旦掌握，若操作正确，每只动物可在一分钟内完成该技术。

进行此操作时，重要的是要轻柔地插入灌胃针，如果遇到任何阻力，最好将其退出，然后按照这些步骤重新插入。还可进行其他方法，如高效液相色谱法（HPLC）、免疫染色和图像分析。这将有助于分析其他区域、该物质的作用效果，甚至在其发育后检测该物质在血液中的存在情况。

该技术为神经科学家研究环境神经毒素对肠神经系统的影响铺平了道路。观看本视频后，您应能够正确应用该测量方法，并分析免疫化学实验所得的图像。切记，接触腐烂物质可能具有极高危险性。

因此，我们建议在进行此操作时佩戴手套和口罩。