Name: 鱼藤酮灌胃和图像分析α- synuclein的夹杂物在肠道神经系统的一个使用口服 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 了解通过灌胃法给予鱼藤酮并分析肠道神经系统中α-突触核蛋白聚集的实验方法。该技术有助于研究农药暴露与帕金森病发病机制之间的关系。

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佩德罗·巴里·德·拉·马萨基金会支持了本项工作。

1) 罗丹明内毒素的胃内给药
<ol>
<li>称量动物体重。</li>
<li>计算所需鱼藤酮/溶剂溶液的总体积。本实验中为每克动物体重0.01 ml。</li>
<li>用1 mL注射器吸取先前计算好的鱼藤酮溶液（0.625 mg/mL鱼藤酮，4%羧甲基纤维素钠和1.25%氯仿）或溶剂溶液（4%羧甲基纤维素钠和1.25%氯仿）体积。本实验中相当于给予5 mg/kg剂量的鱼藤酮。</li>
<li>抓取小鼠，一手握住小鼠尾巴，另一只手用前两指拉住颈部皮肤使其伸展。</li>
<li>当头部被固定于两指之间后，将其靠在手掌上并翻转至倒置位置，用第四和第五指固定尾巴。</li>
<li>保持头部朝向后方，按压腭部以打开小鼠口腔。轻柔地将灌胃针插入小鼠口中。注意必须使用灌胃针而非普通针头。缓慢将灌胃针沿食道方向推进至足够深度，以避免液体进入肺部。</li>
<li>通过轻压注射器推杆给予鱼藤酮溶液或溶剂。给药完成后，缓慢拔出灌胃针。</li>
<li>将动物放回另一笼中，直至同一笼内所有动物处理完毕。</li>
</ol>
2）免疫染色步骤
<ol>
<li>处理后，小鼠通过腹腔注射 Ketamin 100 mg/kg 和 Xylazin 10 mg/kg 进行麻醉，并经心脏灌注 4% 多聚甲醛 PBS 溶液。</li>
<li>随后通过解剖取出肠道组织，置于 15% 蔗糖溶液中过夜。次日，将组织转移至 30% 蔗糖溶液中，于 4°C 再次孵育过夜。</li>
<li>然后将组织置于组织包埋剂（Tissue-tek）中，保存于 -80°C 超低温冰箱中备用。</li>
<li>使用冷冻切片机将 20 微米厚的肠组织横切面转移至 Superfrost 载玻片上。</li>
<li>随后按照先前所述方法 9 进行封闭和免疫染色操作，所用抗体为抗 βIII-tubulin 和抗 alpha-synuclein 抗体。</li>
</ol>
3) α-突触核蛋白包涵体图像分析
建议由不了解图像来源的外部人员进行分析，因此应对数据进行编码。图像分析使用 FIJI 软件完成。
<ol>
<li>打开共聚焦图像文件，然后拆分通道，以便能够独立地对每个通道进行操作。</li>
<li>关闭不使用的通道，选择“分析”&gt;“设置尺度”（Analyze&gt;Set Scale），将像素大小设为 1。将已知距离设为 0.13（该数值取决于所使用的物镜和分辨率），然后点击“全局”（global）。此时图像尺寸将以微米显示。</li>
<li>选择 α-突触核蛋白通道，并选中神经节，确保在所有切片中选择区域完全包围该神经节。</li>
<li>按下“图像”&gt;“复制”（Image&gt;Duplicate）以复制图像。在神经节被选中的情况下，仅会复制与神经节大小相同的图像区域。</li>
<li>按下“编辑”&gt;“清除外部”（Edit&gt;Clear Outside），图像选中区域以外的部分将变为黑色。</li>
<li>再次复制图像，以便在后续步骤中评估该操作的执行效果。信噪比过高或背景过强的图像不应用于图像分析。</li>
<li>选择“图像”&gt;“调整”&gt;“阈值”（Image&gt;Adjust&gt;Threshold），然后选择“最大熵”（MaxEntropy）方法。随后在裁剪后的图像和原始图像之间切换切片，以确认操作效果良好。“熵值阈值”会根据图像的直方图选择一个强度信号水平，只有强度高于该阈值的像素才会在黑白图像中以白色显示。</li>
<li>选择“处理”（Process），然后点击“平滑”（Smooth）。此步骤将图像的像素化边缘转换为平滑边缘。</li>
<li>选择“处理”（Process），然后点击“二值化”（Binary），并选择“转为二值图像”（Make Binary）。图像将以黑底白图的形式显示。</li>
<li>复制图像，以便在复制的图像上执行下一步操作。</li>
<li>点击“分析”&gt;“分析颗粒”（Analyze&gt;Analyze particles），然后选择“显示：轮廓”（Show:Outlines），并点击“汇总”（Summarize）。其余设置保持默认。该功能可识别出具有信号的总像素数以及彼此相连的像素群组，报告内容包括具有信号的像素总面积、像素群组总数及平均大小。</li>
<li>比较并选择最符合要求的最大切片，该切片将被标记。</li>
<li>复制包含总 α-突触核蛋白面积、包涵体数量和平均颗粒大小的数据表，将数据粘贴至 Excel 表格或其他位置进行记录。</li>
<li>返回 FIJI，找到 β-微管蛋白通道中先前选定的切片，并进行选中。</li>
<li>选择神经节区域，点击“分析”（Analyze），然后选择“测量”（Measure）。将出现另一个表格，显示神经节的总面积。</li>
<li>将该表格中的数据提取至 Excel 表格中 α-突触核蛋白测量值附近，或记录到其他位置。</li>
<li>在 Excel 中，将 α-突触核蛋白测量所得的各项参数除以神经节面积，从而获得经神经节大小归一化的总 α-突触核蛋白面积和包涵体数量。</li>
</ol>
4）代表性结果
当灌胃给药操作正确时，对动物造成的不适最小。使用该浓度的鱼藤酮可在肠神经系统（ENS）上产生局部作用，而血液中无鱼藤酮残留，即使经过1.5个月的治疗，也不会抑制肌肉或脑组织线粒体复合物I的活性（见图1）。若图像分析操作得当，应能对α-突触核蛋白的分布模式进行严谨分析。该方法可提供关于α-突触核蛋白总量（总面积）、细胞内α-突触核蛋白分布模式（包涵体数量）以及α-突触核蛋白包涵体存在情况（包涵体大小）的可靠数据（图2）。
 <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig1.jpg" alt="色谱图和柱状图；不同剂量鱼藤酮在血液和中枢神经系统中水平及活性的研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 经鱼藤酮处理的小鼠出现运动功能障碍，但在血液或中枢神经系统中未检测到鱼藤酮。A， 标准品（50 ng/mL）及来自经 20、10 和 5 mg/kg 剂量处理小鼠脑组织样本的色谱图。B 和 C，血液（B）和中枢神经系统（C）中鱼藤酮水平的定量分析。B，给药后 1、2 和 3 小时的血液浓度。小鼠分为三组（n=3），分别给予 2.5、5、10 和 20 mg/kg 的鱼藤酮（n=3），在给药后 1、2 和 3 小时采集 300 μL 血液并混合，用于 HPLC 分析。C，小鼠每日一次连续处理一周，剂量分别为 5（n=3）、10（n=3）和 20（n=1）mg/kg 鱼藤酮，在末次给药后 1 和 2 小时提取脑组织和脑干，制备样品进行 HPLC 分析。D，经 1.5 个月处理小鼠的肌肉和脑组织中线粒体复合物 I 活性。
 <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig2.jpg" alt="βIII-微管蛋白/α-突触核蛋白的荧光显微镜图像、硫黄素S染色、柱状图分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 局部给予鱼藤酮可诱导肠神经系统（ENS）神经节中α-突触核蛋白的磷酸化、积聚和聚集，并伴有胶质增生。（比例尺：20 μm）。A, B, C，十二指肠（B）和回肠（A, C）切片中抗βIII-微管蛋白、α-突触核蛋白及DAPI染色结果。B图中箭头显示，与3个月对照组（A）相比，1.5个月处理组在肠神经系统神经节内出现更明显的α-突触核蛋白点状分布模式。C图中箭头显示，3个月处理诱导形成了更大的α-突触核蛋白包涵体（直径＞6 μm）。D，使用抗α-突触核蛋白抗体、硫黄素S和DAPI进行的免疫荧光染色。D图中箭头显示，仅在处理3个月的小鼠中观察到这些较大α-突触核蛋白积聚物的聚集现象。E, E', E''，图像分析定量步骤。E，用于定量分析的图像示例，显示一个经α-突触核蛋白免疫染色的ENS神经节，可见不同包涵体。E'，图像分析流程完成后获得的图像示例。E''，原始包涵体（绿色）与流程分析后所得结果（黄色线条）之间的部分重叠。F-G，对A-C所示实验结果进行定量分析，采用自动分割和基于熵的阈值化方法。单星号表示P＜0.05，双星号表示P＜0.01。F，每柱代表每个神经节单位面积内α-突触核蛋白总面积。G，每柱代表每个神经节单位面积内α-突触核蛋白包涵体总数。所有图表数据均表示为均值±标准误（s.e.m.）。

<ol><li>Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+alpha-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).</li>
<li>Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+an+immunohistochemical+study+of+Lewy+body-containing+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system.</a> Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).</li>
<li>Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+occurrence+of+Lewy+bodies+in+the+dorsal+vagal+nucleus+in+a+patient+with+late-onset+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism.</a> J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).</li>
<li>Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+lesions+in+dorsal+horn+layer+I%2C+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+pre-+and+postganglionic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons.</a> Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).</li>
<li>Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+development+of+Parkinson%27s+disease-related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology.</a> Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).</li>
<li>Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+Parkinson%27s+disease+with+exposure+to+pesticides%2C+farming%2C+well+water%2C+and+rural+living%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living.</a> Neurology. 50, 1346-1350 (1998).</li>
<li>Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+exposure+to+agricultural+work+and+pesticide+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals.</a> Neurology. 42, 1328-1335 (1992).</li>
<li>Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+antecedents+of+young-onset+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease.</a> Neurology. 43, 1150-1158 (1993).</li>
<li>Pan-Montojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Parkinson%27s+disease+pathology+is+reproduced+by+intragastric+administration+of+rotenone+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice.</a> PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).</li>
<li>Sherer, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+toxicity+in+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).</li>
<li>Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Toxin-induced models of Parkinson's disease.</a> NeuroRx. 2, 484-494 (2005).</li>
<li>Inden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+of+mouse+nigrostriatal+dopaminergic+system+induced+by+repeated+oral+administration+of+rotenone+is+prevented+by+4-phenylbutyrate%2C+a+chemical+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone.</a> J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).</li>
</ol>

Francisco Pan-Montojo 针对该动物模型拥有一项待审批的专利申请（申请号 PCT/EP 2009/005688）。

胃内给药此前已有报道12。然而，根据Inden的论文，鱼藤酮是单独溶解于0.5%羧甲基纤维素钠盐（CMSS）中进行给药的。鱼藤酮是一种高度脂溶性的物质，因此无法单独溶解于0.5% CMSS中，若如此操作将导致沉淀。使用氯仿可形成均匀分布的鱼藤酮混悬液，避免沉淀产生。此外，由于在CMSS中农药浓度更高，所给予溶液的最终体积也显著减少，从而降低了给药过程中的并发症风险。
我们推荐使用直头灌胃针。小鼠的食道呈直线状，直接通向胃的一侧。因此，直头灌胃针更适合此操作。
使用FIJI软件对共聚焦图像进行图像分析。该软件的插件可在线下载。用于图像分析的免疫荧光染色按照先前描述的方法进行9。图像使用LSM 510 Zeiss共聚焦显微镜获取。重要的是，图像应在相同的信噪比条件下获取，这可通过在采集前调整增益和偏移来实现。

<table><tbody><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>德国</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>德国</td></tr><tr><td>羧甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678</td><td>德国</td></tr><tr><td>灌胃针 1.2 mm x 60 mm</td><td>Unimed</td><td></td><td>瑞士</td></tr><tr><td>LSM 510</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://pacific.mpi-cbg.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过灌胃法口服给予鱼藤酮及肠道神经系统中α-突触核蛋白包涵体的图像分析

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

在帕金森病（Parkinson's disease, PD）患者中，相关病理变化遵循一种特征性模式，涉及肠神经系统（enteric nervous system, ENS）1,2、嗅球（olfactory bulb, OB）、迷走神经背核（dorsal motor nucleus of the vagus, DMV）3、脊髓中间外侧核4以及黑质，这些构成了该病神经病理学分期的基础4,5。ENS 和 OB 是最暴露的神经结构，也是最早受累的部位。有趣的是，帕金森病已被发现与农药暴露相关6-8。本文详细描述了我们在先前研究中使用的两种方法9。为了分析鱼藤酮在肠神经系统局部作用的影响，我们通过灌胃方式向一岁的 C57/BL6 小鼠给予鱼藤酮。鱼藤酮是一种广泛使用的农药，可强烈抑制线粒体复合物 I 活性10，具有高度脂溶性，在胃肠道中吸收较差11。我们的结果显示，给予 5 mg/kg 剂量的鱼藤酮并未抑制肌肉或脑组织中线粒体复合物 I 的活性，提示采用本给药方法时，鱼藤酮未进入肝门静脉系统，仅作用于 ENS。本文展示了通过灌胃给予农药的方法，以及用于分析农药对 ENS 中 α-突触核蛋白聚集影响的图像分析流程。第一部分介绍了一种可精确控制浓度进行胃内农药（鱼藤酮）给药的方法；第二部分介绍了一种半自动化的图像分析流程，利用图像分析软件对 ENS 中 α-突触核蛋白的聚集情况进行定量分析。

帕金森病与接触农药有关。本文介绍了一种通过胃管以所需浓度递送农药的方法，以及一种分析农药对肠神经系统中α-突触核蛋白聚集影响的方法。

在帕金森病（Parkinson's disease, PD）患者中，相关病理变化遵循一种特征性模式，其中涉及肠神经系统（enteric nervous system, ENS）1,2, ...

帕金森病的症状，包括运动功能障碍和言语功能障碍，是由于大脑中分泌多巴胺的细胞活性降低所致。肠神经系统和嗅球是暴露程度最高的神经结构，也是最先受累的部位。帕金森病已被发现与农药暴露相关。 为了分析农药对肠神经系统的影响，通过口服灌胃法将农药 roone 施用于小鼠。随后对小鼠进行心内灌注4%多聚甲醛，以固定脑组织和肠神经系统。提取组织并进行制备，随后对与帕金森病（PD）相关的蛋白进行免疫染色。通过共聚焦显微镜获得的βIII微管蛋白和α-突触核蛋白图像显示，在接触农药的动物中，α-突触核蛋白在肠神经系统神经元内发生聚集。与现有的方法（如全身给予鱼藤酮）相比，该技术的主要优势在于能够确保鱼藤酮的作用局限于肠神经系统。该方法有助于回答帕金森病领域的一些关键科学问题，例如其病因以及疾病进展背后的分子机制。该技术的应用意义延伸至帕金森病的治疗与诊断，因为它将有助于开发新的治疗靶点和诊断方法。尽管该方法可为帕金森病的病理生理学提供深入认识，但也可应用于其他系统，例如研究其他环境毒素对肠神经系统、交感神经和副交感神经系统以及肠壁的影响。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为掌握灌胃技术需要一段时间的学习和练习。当我读到关于农药与帕金森病之间关联的研究时，首次产生了这些方法的想法。2005年在柏林举行的世界帕金森病大会期间，看到高CORAs会议的展示也提供了很大帮助。平和地演示这一方法十分必要。使用灌胃法给予油剂具有难度，因为小鼠的解剖结构与人类不同；另一方面，这些图像的图像分析采用了定制化的步骤。开始实验方案前，首先称量动物体重，然后计算适当剂量的鱼藤酮体积。每克动物体重需要 0.01 毫升，相当于每千克体重五毫克的 roone 剂量。用 roone 溶液填充一支一毫升注射器，然后用溶剂溶液填充第二支注射器。抓起小鼠，用一只手握住小鼠的尾巴。用另一只手的前两个手指拉伸颈部皮肤。将头部固定在两指之间后，将其靠在手掌上并翻转至倒置位置。固定尾巴。用无名指和小指固定小鼠头部于后方，按压腭部以打开小鼠口腔。轻柔地将灌胃针插入小鼠口中，沿胃的方向缓慢推进，直至完全插入灌胃针全长。为避免物质进入肺部，应轻柔推动注射器栓芯，将roone溶液或溶剂灌胃给药。操作完成后，缓慢拔出灌胃针，将动物放回另一笼中，直至该笼所有动物处理完毕。处理结束后，小鼠经心腔灌注4%多聚甲醛进行灌流。在 PBS 中，通过解剖取出肠道并置于 15% 蔗糖溶液中过夜。次日，将组织转移至 30% 蔗糖溶液中，在 4°C 下再次孵育过夜。随后将组织放入 -80°C 超低温冰箱中保存备用。使用冷冻切片机切取 20 微米厚的肠组织切片。将横切面转移至载玻片，进行封闭和免疫染色操作。随后使用抗βIII微管蛋白和抗α-突触核蛋白抗体进行孵育。建议由外部人员对数据进行盲法分析。开始分析时，打开 Fiji 软件，载入共聚焦图像文件，然后拆分通道，以便能够独立地对每个通道进行操作。关闭不使用的通道，选择、分析、设置、缩放，并将像素大小设为1。将已知距离设为0.13，然后单击全局。此时图像的尺寸将以微米显示。选择α-突触核蛋白通道并选中神经节。确保在所有切片中选择范围完全包围该神经节。复制仅包含所选神经节的图像，此时仅会复制与神经节大小相同的图像区域。按编辑清除，选定区域外的图像部分将变为黑色。再次复制图像以评估操作效果。信噪比较低的图像不应用于图像分析。选择图像并调整阈值，然后选择最大熵。接着在裁剪后的图像和原始图像的各个切片上移动，以确保操作过程正确无误。阈值选择基于图像直方图选取一个强度信号水平，只有强度高于此阈值的像素才会在黑白图像中显示出来。然后点击“平滑”按钮。此步骤将图像的像素化边缘转换为平滑边缘。然后点击二值化并选择“生成二值图像”。图像将显示为黑白图像。为在复制的图像上执行下一步操作，请点击分析，选择分析颗粒。然后勾选显示轮廓，并点击汇总。其余设置应保持默认。该功能可识别出具有信号的像素总数以及聚集在一起的有信号像素的总面积，同时报告像素群组的数量及平均大小。比较并选择总面积最大且贴合良好的切片。该切片将被标记。复制包含总α-突触核蛋白表面、包涵体数量和平均颗粒大小的数据表。将数据粘贴到 Excel 电子表格中或在其他位置进行标注。返回 Fiji。在 β-tubulin 通道中找到先前选定的切片并选中它。选择神经节区域，然后点击分析。接着选择测量。将出现另一个表格，显示神经节的总面积。将表格中的数据提取到 Excel 电子表格中，靠近 α-突触核蛋白测量值的位置，或在其他位置使用 Excel 进行复制。将 α-突触核蛋白测量中获得的不同参数除以神经节表面积，以获得经神经节大小归一化的总 α-突触核蛋白表面值和包涵体数量，从而分析罗丹宁对肠神经系统局部作用的影响。对 1 年龄的 C57BL/6 小鼠通过口服灌胃给予每千克体重 5 毫克的杀虫剂罗丹宁。此处显示的色谱图展示了给药后 1 小时对照小鼠中罗丹宁峰的存在情况，对照小鼠分别接受了每千克体重 20 毫克和每千克体重 5 毫克罗丹宁的处理。通过高效液相色谱法（HPLC）测定血液、脑组织及脑干提取物中的鱼藤酮水平，结果如图所示。以5毫克/千克剂量经口灌胃给予鱼藤酮后，在给药后1小时、2小时及3小时均未在小鼠血液中检测到可测水平，该结果由HPLC确定。本图展示了经处理小鼠脑组织和脑干中的鱼藤酮含量。给予每公斤10毫克或更低剂量的鱼藤酮后一小时，在脑或脑干样本中未检测到鱼藤酮水平。给药后一小时，检测了经1.5个月处理的小鼠肌肉和脑样本中线粒体复合物Ⅰ的活性。各组之间无显著差异，表明线粒体复合物Ⅰ未受抑制，从而证实这些区域不存在鱼藤酮作用。在给予rone后，对帕金森病路易小体成分α-突触核蛋白进行分析，可可靠地确定α-突触核蛋白的总表面含量、α-突触核蛋白包涵体的存在情况以及细胞内α-突触核蛋白的分布模式。该图显示了十二指肠和回肠切片中抗βIII微管蛋白、α-突触核蛋白和DAPI染色结果，如图所示。与对照组相比，1.5个月的roach处理在肠神经系统神经节内诱导出更明显的α-突触核蛋白点状分布模式，即使与3个月的对照组相比也是如此。该模式在回肠和十二指肠中均可观察到。经过三个月的治疗后，通过使用抗α-突触核蛋白、theof、黄素和DPI进行免疫荧光染色，可观察到较大的α-突触核蛋白包涵体的形成，且仅在三个月时显示出较大α-突触核蛋白聚集体的聚集。本实验采用自动分割和基于熵的阈值方法进行分析。在左侧的图中，每根柱子代表α-突触核蛋白表面与神经节表面的总比值。在右侧的图中，每根柱子代表每个神经节表面所检测到的α-突触核蛋白包涵体的总数。这些数据共同表明，局部给予鱼藤酮可诱导肠神经系统神经节中α-突触核蛋白的磷酸化、积聚和聚集，并伴随胶质增生。一旦掌握该技术，若操作正确，每只动物可在一分钟内完成。进行该操作时，重要的是要轻柔地插入灌胃针，如果遇到任何阻力，最好将其退出，然后按照这些步骤重新插入。还可采用其他方法，如高效液相色谱法（HPLC）、免疫染色和图像分析。这将有助于分析其他区域、该物质的作用效果，甚至在其代谢后检测其在血液中的存在情况。该技术为神经科学家研究环境神经毒素对肠神经系统的影响铺平了道路。观看本视频后，您应能够正确使用测径器并分析免疫化学实验所得的图像。请务必注意，操作腐烂物质可能具有极高危险性。因此，我们建议在进行此操作时佩戴手套和口罩。

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鱼藤酮灌胃和图像分析α- synuclein的夹杂物在肠道神经系统的一个使用口服

本视频演示了将α-突触核蛋白纤维注射到小鼠体内以诱导神经炎症的过程。这些纤维被注射到表达突变型α-突触核蛋白的转基因小鼠腹腔内。当纤维到达中枢神经系统后，会进入神经元并诱导突变蛋白发生聚集。这些聚集物会扩散至邻近的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞。小胶质细胞识别这些聚集物后被激活，引发神经炎症，从而损伤神经元。...

通过注射α-突触核蛋白纤维在小鼠中诱导神经炎症

本文描述了一种提供新型定量方法的ELISA。该方法利用针对Ser129磷酸化α-突触核蛋白（αS）形式或该蛋白C端区域的多种抗体，在突触核蛋白病的转基因小鼠模型（M83）中特异性检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αSD）。...

检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

本文描述了病毒载体介导的局部基因递送如何为在中枢神经系统中表达外源基因提供一种有效的方法。该方案概述了在大鼠黑质内注射病毒载体以建立基于病毒载体的帕金森病动物模型所需的全部关键步骤。...

基于α-突触核蛋白的帕金森病大鼠模型通过重组腺相关病毒载体立体定向注射的建立方法

向表达人类α-突触核蛋白A53T家族性突变和萤火虫荧光素酶的Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠腹腔或舌部外周注射α-突触核蛋白纤维，可诱导其中枢神经系统产生神经病理学改变，包括神经炎症。...

转基因小鼠外周接种α-突触核蛋白纤维后神经炎症的生物发光成像

本文介绍一种用于自动半定量测定大鼠黑质致密部多巴胺能神经元数量的方法。...

使用自动图像分析法对啮齿类动物模型黑质中多巴胺能神经元密度进行半定量测定

本文展示了如何使用七分评分系统，对 C. elegans...

量化多巴胺能神经元形态改变与变性水平 秀丽隐杆线虫

本研究分析了在帕金森病临床前模型中诱导神经炎症、神经变性及运动功能障碍所需的病毒载体剂量和暴露时间。这些编码人源α-突触核蛋白的载体被递送至黑质 ，以重现与帕金森病相关的突触核蛋白病理变化。...

分析由编码人α-突触核蛋白的腺相关病毒载体诱导的帕金森病小鼠模型

介绍了一种便捷的重力灌注法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析。在帕金森病小鼠模型中，展示了磷酸化α-突触核蛋白的免疫荧光检测。本研究还全面描述了经心脏灌注、解剖、组织冷冻/包埋以及冷冻切片等步骤。...

一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法

本方案描述了一种鼻内给予α-突触核蛋白聚集体的方法。该方法有助于研究帕金森病中α-突触核蛋白从嗅黏膜向嗅球的传播过程。...

α-突触核蛋白聚集体鼻内给药技术

本文详细描述了一种在小鼠胚胎发育第14.5天（E14.5）对大脑皮层和海马体进行子宫内电穿孔的实验方案。我们还证明，该方法是研究这两个脑区中树突和树突棘的有力工具。...

利用可视化与遗传学操作技术研究小鼠大脑皮层和海马中的树突及树突棘 在子宫内 电穿孔

了解通过灌胃法给予鱼藤酮并分析肠道神经系统中α-突触核蛋白聚集的实验方法。该技术有助于研究农药暴露与帕金森病发病机制之间的关系。

通过灌胃法口服给予鱼藤酮及肠道神经系统中α-突触核蛋白包涵体的图像分析

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