基于短杆菌肽的荧光检测法；用于测定小分子改变脂双层性质的潜力

本实验的总体目标是测量药物诱导的双分子层特性变化，这些变化由跨越双分子层的蛋白质感知。该目标首先通过制备荧光染料负载的大型单侧脂质体来实现。实验的第二步是用短杆菌肽对囊泡进行掺杂。

该步骤的第三步是加入外部淬灭剂，并测量内部荧光基团的淬灭速率。四、该步骤的最后一步是通过将拉伸指数函数拟合到荧光时间过程，量化每单位酶活性的荧光淬灭变化。最终可获得结果，以评估amfi蛋白是否能够改变脂双层的性质。

您好，我是 Ola Anderson。您好，我是 Helson。您好，我是 Richie Kapo。

我是来自威尔康奈尔医学院生理学与生物物理学系奥拉夫·安德森博士实验室的 Leah Sanford。今天我们将向您展示一种用于测量脂质双分子层性质变化的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究药物和小分子对脂质双层性质的影响。

那么，我们开始吧。在此实验程序的第一天，从冰箱中取出脂质，使其升至室温。待其平衡后，向一个25毫升的圆底烧瓶中加入0.6毫升浓度为25毫克/毫升的脂质氯仿溶液。然后在持续旋转烧瓶的同时，用氮气吹干溶液，直至所有氯仿完全蒸发。

在烧瓶下半部分形成一层薄薄的白色脂质膜，将其置于真空干燥器中过夜，进一步干燥脂质。配制含有100毫摩尔/升硝酸钠、25毫摩尔/升 ANTS 和10毫摩尔/升 HEPES（pH为7）的溶液。调节该溶液pH时，避免使用任何含氯的溶液。

由于铊淬灭剂在第二天会与氯化物形成不溶性复合物，因此在1.67毫升电解质溶液中重新水化脂质，以获得10毫摩尔的脂质悬浮液。达到正确浓度后，用封口膜覆盖，充分涡旋混匀，并用铝箔包裹以避光，然后在室温下静置过夜老化。

第3天，将混合物在低功率超声仪中进行一分钟的超声处理。然后进行冻融循环：先在干冰上放置5分钟，再放入温水中5分钟，重复此冻融过程四到五次。使用Avanti微型挤出器挤出脂质悬浮液。

使用带有0.1微米聚碳酸酯滤膜及滤膜支撑装置的微型挤出器，将悬浮液来回挤出21次，直至几乎透明的悬浮液出现在另一端的注射器中，从而制备得到大单层囊泡（LUV）悬浮液。通过已用钠缓冲液平衡的PD-10脱盐柱去除外部的ANTS，将挤出后的悬浮液上柱。向柱中加入1.5毫升LUV悬浮液和1毫升钠缓冲液。

当溶液完全进入层析柱后，用三毫升钠缓冲液洗脱脂质体，并收集洗脱液。所得的 A NTS 填充型大单层脂质体（LUV）储备液应含有约 4 至 5 毫摩尔/升的脂质，呈半透明、乳白色。

用铝箔避光保护溶液，并在使用前24小时于13摄氏度保存，使用前充分涡旋振荡。ANTs填充的LUV储备溶液。由于UUVs的密度大于1克/毫升和/或会发生沉降。

然后用钠缓冲液将装有 A NTS 的大单层囊泡（LUV）储备溶液稀释至 1:20。取四分之三的脂质体与 260 纳克溶于 DMSO 的 abidin 共同孵育，向剩余的四分之一中加入等体积不含 gramin 的 DMSO。

为保持所有样品中溶剂浓度恒定，将格拉明在13摄氏度下于脂质囊泡的内层和外层单分子层之间平衡24小时。此处使用配备温度控制的Applied Photophysics SX.20停流光谱荧光仪来测定荧光猝灭速率。开始前，提前一小时开启仪器，以确保仪器充分预热。

激发用的狭缝应设置为1/1，记录发射时应使用55纳米的高通滤光片，并使用pro data SX软件进行记录。首先设置记录条件，将单色仪的激发波长设为352纳米。使用压力保持设置。

将时间设置为1秒，采样点设置为5,000。缓冲液运行的重复次数调整为9次，淬灭剂运行的重复次数调整为13次。在Essex软件中通过检查驱动配置文件来监测温度。

驱动体积应设置为120微升，即从每支注射器中混合60微升，由此产生的死区时间约为1.2毫秒。将荧光检测器的高压或增益调节至约420伏。

目标是获得约八个荧光读数，将先前制备的装载了 A NTS 的 UUV 在 25 摄氏度避光条件下平衡 10 分钟。平衡完成后涡旋样品，然后将其装入左侧注射器中。在右侧注射器中装入钠缓冲液或铊淬灭剂。

通过来回推动注射器排除任何气泡。两个注射器应等量装填。在关闭第一个样品的阀门之前，用钠缓冲液记录荧光信号。

重复四次，并根据需要调整增益。然后对剩余样品再重复五次。用钠缓冲液记录九次重复。

将钠缓冲液替换为铊淬灭剂，并记录13次重复。用水冲洗后，继续进行下一个样品的对照。包括不含gramin但含溶剂的样品，以及不含gramin但含有最高化合物浓度的样品。

在进行荧光检测时，同时使用格拉明和溶剂，并将数据读入 MATLAB 软件进行分析。对于每个样本，需读取所有缓冲液和淬灭剂的重复数据，其中前四次重复会受到管路中先前残留物质的污染。在此情况下，信号来源于前次清洗残留的水与钠缓冲液样本混合所产生的结果。

第五至第九个循环代表样品本身的信号。因此，我们在每种情况下始终排除前四个循环。为避免任何混合干扰，需手动检查曲线，剔除任何异常的循环，例如因混合干扰或气泡导致出现尖峰或偏差的红色曲线。

然后将每个样品在每种实验条件下淬灭剂重复组的数据归一化至对应缓冲液重复组的平均起始值，将所有样品的平均值合并绘制为一张可视化图，其中不含格拉明的样品应结果相似且几乎不显示荧光淬灭。对于含格拉明的样品，由于铊离子缓慢进入囊泡，荧光信号会缓慢降低。如果该化合物明显改变了荧光时间进程，则表明该化合物在所测试浓度下改变了脂双层性质，接下来应对归一化荧光淬灭曲线的前2至100毫秒数据拟合拉伸指数函数。

对各个重复实验在两毫秒时计算反应速率，然后根据各个重复实验计算给定样本的平均值和标准差。此处以 cap 表示的辣椒素对荧光淬灭动力学的影响，在无或有以 ga 表示的姜黄素存在条件下进行观察，归一化的荧光信号在此显示为一秒内的变化。灰色圆点代表所有重复实验的结果，而红色线条代表平均值。

显示了归一化荧光信号的前 100 毫秒。灰色圆点表示每种条件下单次重复的实验结果。红色线条是对这些重复结果进行拉伸指数拟合的曲线。

被抑制的蓝色线条表示两毫秒的时间点，即淬灭速率的测定时刻。通过将数据归一化到含有生物碱但无修饰剂的对照样品，来确定淬灭速率的相对变化。

当辣椒素结合到脂质双分子层时，会改变双分子层的性质。双分子层变软的变化将反映为单体-二聚体平衡向有利于导电性二聚体的方向移动。我们刚刚向您展示了一种用于测量小分子对脂质双分子层扰动效应的实验方法。

进行此实验操作时，重要的是要记住，每次实验均需使用同一批次的囊泡，并设置适当的对照。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。