Name: 短杆菌肽为基础的荧光分析法，确定小分子的修改脂质双层属性的潜在 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 了解基于短杆菌肽的荧光分析法，用于评估小分子药物对脂质双层特性的影响。该方法通过测量荧光猝灭速率来监测通道活性，为研究膜蛋白与药物相互作用提供快速可靠的实验手段。

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感谢 Michael J. Bruno、Radda Rusinova 和 Jon T. Sack 的许多富有启发性的讨论。OSA 获得美国国立卫生研究院（NIH）R01GM021342 项目及 ARRA 增补项目 R01GM021342-35S1，以及 Josiah Macy, Jr. 基金会的资助；HII 获得 Tri-I CMB 项目支持；RK 获得 Iris L. 和 Leverett S. Woodworth 医学科学家奖学金以及 NIH MSTP 资助项目 GM07739 的支持。

1. 制备 ANTS 负载的脂质体
<ol>
 <li>第1天，从脂质中去除有机溶剂。</li> 
	<li>从冷冻柜中取出脂质，使其平衡至室温。</li> 
	<li>向一个25 mL的圆底烧瓶中加入0.6 mL氯仿溶液，其中含有浓度为25 mg/mL的1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷胆碱脂质。</li> 
	<li>在氮气下持续旋转烧瓶进行干燥，直至所有氯仿完全蒸发，烧瓶下半部分形成一层均匀的白色脂质薄膜。</li> 
	<li>在真空干燥器中干燥过夜。</li>
</ol>
<ol>
 <li>第2天，准备将要掺入囊泡中的荧光染料样品。</li> 
	<li>用100 mM NaNO3、25 mM ANTS（钠盐）、10 mM HEPES重悬。使用HNO3或NaOH将pH调节至7.0。每个ANTS分子含有2个Na+，因此Na+总浓度为150 mM。加入1.671 mL电解质溶液，制成10 mM脂质悬浮液。</li> 
	<li>用Parafilm封口，并充分涡旋振荡悬浮液。</li> 
	<li>用铝箔包裹样品以避光，并在室温下静置过夜。</li>
</ol>
<ol>
 <li>第3天，制备大单层囊泡，并去除囊泡外的所有荧光染料。</li> 
	<li>在低功率超声波破碎仪中进行1分钟的超声处理。</li> 
	<li>将样品进行5–6次冻融循环，每次在干冰上放置5分钟，随后在约50 °C温水中放置5分钟。</li> 
	<li>使用Avanti微型挤出器对脂质悬浮液进行挤出。将微型挤出器装配0.1 μm聚碳酸酯滤膜及滤膜支撑片（具体操作参见挤出器说明书）。将悬浮液在两个注射器之间来回挤出21次，使最终悬浮液位于相反的注射器中。当挤出多批次样品时，始终使用同一注射器加样。挤出过程中，初始浑浊的脂质悬浮液应逐渐变为近乎透明（由于ANTS荧光染料的存在，仍呈黄色）。若挤出时阻力突然减小，推动滤膜所需压力降低，可能表明滤膜已破裂，需更换新滤膜。</li> 
	<li>通过PD-10脱盐柱（采用重力法）去除外部的ANTS。用20–30 mL Na缓冲液（140 mM NaNO3、10 mM HEPES，pH 7.0，注意使用HNO3或NaOH调节pH）平衡脱盐柱。将1.5 mL挤出后的脂质悬浮液加至柱顶，待其完全渗入。再加入1 mL Na缓冲液，使样品总体积达到2.5 mL。待缓冲液完全进入柱体且无液体滴出后，用3 mL Na缓冲液洗脱脂质体，并收集洗脱液。所得的ANTS包载大单层囊泡（LUV）储备液应含有约4–5 mM脂质，呈半透明乳白色。用铝箔包裹样品，避免光照。</li> 
	<li>若储备液不立即使用，可在13 °C下保存，最长不超过7天。警告：切勿将脂质溶液冷冻或冷却至其液相–晶相转变温度（约12 °C）以下，否则将破坏囊泡完整性，导致荧光染料泄漏。</li>
</ol>
2. 配制荧光溶液
<ol>
 <li>使用前24小时，将脂质体稀释并与短杆菌肽（gramicidin）共同孵育（在 13 °C。短杆菌肽在脂质体内外单层膜之间的平衡是一个缓慢的过程，需要长时间孵育。</li> 
	<li>充分涡旋混合含有 ANTS 的 LUV 储存液，因为 LUVs 具有密度 &gt;1 g/mL，因此会在溶液中沉降。</li> 
	<li>将ANTS填充的LUV储备液按1:20比例加入Na缓冲液中混匀。将一天实验所需的所有脂质体在单个烧瓶中混合，以提高样品的均一性。</li> 
	<li>分离出 3/4 的脂质体，并加入用 DMSO 预稀释的 260 nM 短杆菌肽500 μg/mL). </li> 
	<li>向剩余的1/4中加入等体积的DMSO（不含短杆菌肽），以保持所有样品中溶剂浓度一致。</li>
</ol>
3. 荧光仪器的设置
<ol>
 <li>我们使用带有温度控制的 Applied Photophysics SX.20 停流光谱荧光仪来测量荧光猝灭速率。</li> 
	<li>提前一小时开启仪器，使其充分预热。组件包括：计算机、电子控制单元、水浴装置（包括冷却器和加热器）、光源电源以及氮气罐。</li> 
	<li>使用 Pro-Data SX 软件设置记录条件。</li> 
	<li>将单色仪的激发波长设为 352 nm，激发狭缝宽度设为 1/1。</li> 
	<li>使用 λ=455 nm 的高通滤光片记录发射光。</li> 
	<li>启用“压力保持”（Pressure Hold）设置，使仪器在记录过程中维持氮气压力，从而防止最初几毫秒内出现压力波动（及记录伪迹）。</li> 
	<li>将“时间”设为 1 秒，“数据点数”设为 5000。</li> 
	<li>启用重复功能并调整重复次数，通常缓冲液运行设为 9 次，猝灭剂运行设为 13 次。</li> 
	<li>水浴温度应设置为 25°C，并在 SX 软件中监测温度。</li> 
	<li>将驱动体积设为 120 μL，表示仪器每次运行时从两个注射器中各吸取 60 μL 混合。在此仪器设置下，120 μL 的体积可提供约 1.2 ms 的死时间。</li> 
	<li>调节荧光检测器的高压（增益），使 ANTS-脂质体的输出信号约为 8。对于标准实验体系，增益通常应设为 400–420 V。某些药物具有荧光，可能导致荧光信号饱和；在此情况下，应降低增益/电压。</li> 
	<li>始终将荧光样品装入左侧注射器，缓冲液/猝灭剂装入右侧注射器。装样前务必对所有含脂质体的样品进行充分涡旋混匀，并注意大单层脂质体（LUVs）会随时间在注射器内沉降。</li>
</ol>
4. 进行实验
<ol>
 <li>准备含有 ANTS 的大单层囊泡（LUVs）样品，分别加入溶剂或待测化合物，并将样品与 Na-缓冲液或 Tl-淬灭剂（50 mM TlNO3、94 mM NaNO3、10 mM HEPES，pH 7.0）一同装入荧光分光光度计中。</li> 
	<li>使用前一天制备的 1.5 mL 稀释 ANTS-LUV 溶液，可含或不含短杆菌肽（gramicidin）。</li> 
	<li>向样品中加入目标浓度的化合物或对照用的溶剂。所有样品中的溶剂浓度应保持最低且恒定。对于新（未知）化合物，需调整浓度以获得理想的剂量-反应范围。在 25°C 避光条件下孵育 10 分钟。</li> 
	<li>将 LUV 样品充分涡旋混匀后装入左侧注射器，将 Na-缓冲液或 Tl-淬灭剂装入右侧注射器。</li> 
	<li>通过前后推动注射器彻底排除两个样品中的气泡。</li> 
	<li>关闭阀门前确保两个注射器装载体积相等。装载不均会导致溶液在进入记录室之前发生预混合。</li> 
	<li>对于第一个样品，先用 Na-缓冲液记录荧光信号 4 次，根据需要调节高压（增益），再重复记录 5 次。</li> 
	<li>对于其余样品，使用 Na-缓冲液连续记录 9 次重复。</li> 
	<li>将 Na-缓冲液更换为 Tl-淬灭剂，并连续记录 13 次重复。</li> 
	<li>用水冲洗系统后继续下一个样品。作为对照，我们使用以下样品：不含短杆菌肽并含溶剂、不含短杆菌肽但含最高浓度化合物、同时含短杆菌肽和溶剂。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
 <li>将结果转移至分析计算机。将所有数据读入 MATLAB 进行分析。对于每个样品，读取所有缓冲液和淬灭剂的重复数据，但需排除每组的前四次数据，因其包含混合伪影。假设驱动体积为 120 μL 清除停流管路中前一次混合物所需的冲洗次数略少于四次。</li> 
	<li>所有样品的缓冲液重复性应非常接近。如果荧光信号出现显著偏移，而该信号依赖于化合物浓度，则该化合物本身可能具有荧光性，此时可能需要在对样品进行归一化之前，先减去这一额外的荧光信号。</li> 
	<li>手动检查轨迹，剔除“不良”重复：由于混合不均和/或气泡导致出现尖峰或偏离多指数衰减特征的重复数据。</li> 
	<li>将每个样本的淬灭剂重复组数据归一化至其缓冲液重复组的平均起始值。将所有样本的平均值合并绘制在同一张图中以进行可视化。</li> 
	<li>未加入短杆菌肽的记录曲线应全部相似，且几乎不显示荧光淬灭；可能由于Tl的缓慢泄漏，荧光信号出现缓慢降低+ 通过囊泡双分子层8。如果未添加短杆菌肽且未添加修饰剂的样品显示出显著的荧光淬灭，则说明囊泡已降解，不应继续使用。如果未添加短杆菌肽但含有修饰剂的样品显示出显著的荧光淬灭，则表明该修饰剂对囊泡双分子层造成了足够程度的扰动，使得荧光探针或淬灭剂能够穿过双分子层。</li> 
	<li>如果该化合物改变了脂质双分子层的性质（可通过短杆菌素通道检测），荧光时间进程将发生明显变化。</li> 
	<li>对于每个样本，采用拉伸指数函数 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="弛豫函数方程；科学分析；瞬态吸收；数据拟合方法" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> 例如 4) 拟合至各重复实验中归一化荧光淬灭曲线的前 2-100 毫秒部分，并计算其速率 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="时间依赖性分析中的速率方程；公式：rate(t) = (β/τ₀)•(t/τ₀)^(β-1)" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2">4 在2 ms时计算。针对给定样本，从所有独立重复实验中计算平均值和标准差。</li> 
	<li>最后，通过将淬灭速率相对于时间上最接近的、含有短杆菌肽但无修饰剂的对照样品进行归一化，确定淬灭速率的相对变化。</li>
</ol>
6. 典型结果
<img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="荧光淬灭示意图；发射/激发过程；含囊泡的光谱检测装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1：基于荧光淬灭的检测方法核心原理，用于检测脂双层性质的变化。 左上方：单个脂质囊泡的放大图，其内部含有 ANTS 和 NaNO3，外部为 NaNO3 和 TlNO3。右上方：使用（从上到下）不含淬灭剂的 ANTS 填充囊泡、含淬灭剂的囊泡，以及预先掺入 87、260 和 780 nM 短杆菌肽的含淬灭剂囊泡所记录的荧光信号。下方：停流混合室的示意图。
<img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="荧光光谱仪设置界面；光学激发测量；数据采集设置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2：Pro-Data SX 软件的界面截图，展示了实验装置描述中所涉及的各个功能面板。
<img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="荧光强度随时间变化图；稳定性分析、多次重复、实验数据比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3：使用Na缓冲液的ANTS负载LUVs荧光信号的多次重复测定。 前四次重复始终被排除，因其包含混合干扰。连接样品注射器与混合池的管路具有固定体积，因此前几次重复反映的是管路中先前残留的物质：第1次和第2次为水，第3次为水与样品的混合物，第4次主要为样品，其余重复则仅为样品。 
<img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="荧光衰减图，Tl-淬灭剂与Na-缓冲液，瞬态吸收测量结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4：使用Na-缓冲液和Tl-淬灭剂的ANTS负载型LUVs荧光信号的多次重复测定。 两种条件下的前四次重复数据已被剔除。此外，对于Tl-淬灭剂的测量，第8次重复由于存在干扰（最可能是气泡所致）也需剔除。
<img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="荧光衰减分析；曲线图；相对荧光强度随时间变化；淬灭效应测量。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5：辣椒素（Cap）对 ANTS 荧光淬灭过程的影响。 （A）1 秒内的归一化荧光信号，灰色圆点表示所有重复实验的结果（每种条件下重复次数 n &gt; 5）；红色线条表示所有重复实验的平均值。（B）前 100 毫秒的数据，灰色圆点表示每种条件下单次重复实验的结果；红色线条为对这些重复数据在 2–100 毫秒范围内的拉伸指数拟合。虚线蓝线表示 2 毫秒的时间点，淬灭速率在此时间点确定。在 A 和 B 中，最上方的曲线表示无 Tl+ 条件下的结果；接下来两条曲线表示无 gA 存在、含 Tl+ 且分别添加或不添加 Cap 的结果；下方四条曲线表示含 260 nM gA 和 Tl+ 的条件，其中数字表示 Cap 的浓度（单位为 μM）。通过拉伸指数拟合确定的 0、10、30 和 90 μM Cap 条件下的淬灭速率分别为 36±6、69±6、85±8 和 247±27（均值 ± 标准差，n &gt; 8）。

<ol><li>Andersen, O. S. Ion transport through simple membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+OS+%22Renal+Function%22">Renal Function</a>. Giebisch, G. H., Purcel, E. F. , The Josiah Macy, Jr. Foundation. New York. (1978).</li>
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<li>Keserü, G. M., Makara, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+lead+discovery+strategies+on+the+properties+of+drug+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).</li>
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<li>Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+optimum+lipophilicity+and+molecular+weight+ranges+for+drug+candidates-Molecular+weight+dependent+lower+logD+limits+based+on+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).</li>
</ol>

已提交一项涵盖本文所述方法的临时专利申请。共同发明人为 HII 和 OSA。

我们已展示了一种基于荧光的快速检测方法，用于测定药物及其他小分子两亲性化合物对脂双层的调节潜力。能够改变脂双层性质的化合物可能会以间接且非特异性的方式影响膜蛋白功能，这可能与药物的“脱靶”效应有关。该检测方法利用短杆菌肽通道（gramicidin channels）作为探针，检测跨膜蛋白所感知的脂双层性质变化12。基于荧光的检测结果与单通道gA实验结果高度一致12，表明该方法既可用于机制研究，也可用于化合物库的筛选。采用当前的检测配置，我们每天可测试数十种化合物，通量比单通道方法高出一到两个数量级。基于荧光的检测方法不存在根本性的速率限制步骤，意味着其可进一步扩展为真正的高通量模式。可以调整检测所用的电解质溶液，和/或使用不同脂质组成的LUVs。需要注意的是，某些脂质组成在干燥过程中可能发生相分离，此时需采用快速溶剂交换系统，而非传统的干燥-水化步骤7。
目前尚不清楚药物先导物的脂溶性增加与药物研发过程中的淘汰率上升之间是否存在因果关系10,11,17，如果存在，其潜在的机制是什么？然而，由于...

<table><tbody><tr><td>ANTS</td><td>Invitrogen</td><td>A-350</td><td></td></tr><tr><td>短杆菌肽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5002</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850398C</td><td></td></tr><tr><td>微型挤出器试剂盒</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱盐柱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54805</td><td></td></tr></tbody></table>

基于短杆菌肽的荧光检测法；用于测定小分子改变脂双层性质的潜力

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

许多用于调节生物功能的药物及其他小分子是两亲性化合物，可在双分子层/溶液界面吸附，从而改变脂质双分子层的性质。这一点非常重要，因为膜蛋白通过疏水相互作用与其所在的脂双层在能量上相互耦合。因此，脂双层性质的改变会影响膜蛋白的功能，这为两亲性分子间接调节蛋白质功能提供了途径，也可能是药物“脱靶”效应的潜在机制。我们此前已开发出一种电生理检测方法，利用线性短杆菌肽（gramicidin）通道作为探针来检测脂质双分子层性质的变化3,12。短杆菌肽通道是由两个非导电性亚基跨双分子层形成二聚体而构成的微型蛋白质。它们对膜环境的变化高度敏感，因此可作为强有力的探针，用于监测跨膜蛋白所感知的脂双层性质的改变。目前，我们展示了一种基于相同通道作为探针的荧光检测方法。该方法通过测量荧光探针标记的大单层囊泡（large unilamellar vesicles）在淬灭剂经由短杆菌肽通道进入后所发生的荧光淬灭动力学过程，来实现检测。我们采用8-氨基-1,3,6-萘三磺酸（8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate, ANTS）与Tl+作为荧光指示剂/淬灭剂组合，该组合已在其他荧光淬灭实验中成功应用5,13。Tl+穿过脂双层的速度较慢8，但可轻易通过导电态的短杆菌肽通道1,14。该方法具有可扩展性，既适用于机制性研究，也适用于对小分子是否具有扰动脂双层及潜在“脱靶”效应的高通量筛选。我们发现，采用该方法所得结果与此前的电生理实验结果具有良好的一致性12。

我们介绍一种基于荧光的快速检测方法，通过监测荧光淬灭速率来反映短杆菌肽通道的活性。短杆菌肽通道作为分子力传感器，用于监测跨膜蛋白所感知的脂双层特性的变化。

许多用于调节生物功能的药物及其他小分子是两亲性物质，它们吸附在双分子层/溶液界面，从而改变……

本实验的总体目标是测量药物诱导的双分子层特性变化，这些变化由跨双分子层蛋白感知。首先制备负载荧光染料的大型单侧囊泡，以实现这一目标。实验的第二步是用短杆菌肽对囊泡进行掺杂。该实验步骤的第三步是加入外部淬灭剂，并测量内部荧光基团的淬灭速率。第四步是通过将拉伸指数函数拟合到荧光时间过程，定量分析每克活性中荧光淬灭的变化。最终，可获得结果以评估amfi蛋白是否能够改变脂双层的性质。您好，我是 Ola Anderson。您好，我是 Helson。嗨，我是 Richie Kapo。我是来自康奈尔大学威尔医学学院生理学与生物物理学系奥拉夫·安德森博士实验室的 Leah Sanford。今天我们将向您展示一种用于测量脂质双分子层性质变化的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究药物和小分子对脂质双层性质的影响。首先，让我们开始实验操作。在实验第一天，从冷冻柜中取出脂质，使其平衡至室温。待其充分平衡后，向一个25毫升的圆底烧瓶中加入0.6毫升浓度为25毫克/毫升的脂质氯仿溶液。随后，在持续旋转烧瓶的同时，用氮气吹干溶液，直至所有氯仿完全蒸发。一层薄薄的白色脂质膜覆盖烧瓶的整个下半部分，将脂质在真空干燥器中进一步干燥过夜。配制含有100毫摩尔/升硝酸钠、25毫摩尔/升 ANTS 和10毫摩尔/升 HEPES（pH为7）的溶液。调节该溶液pH时，避免使用任何含氯的溶液。由于铊淬灭剂在第二天会与氯化物形成不溶性复合物，因此在1.67毫升电解质溶液中重新水化脂质，以获得10毫摩尔的脂质悬浮液。达到正确浓度后，用封口膜封住容器，充分涡旋混匀，并用铝箔包裹以避光，然后在室温下静置过夜老化。第三天，在低功率超声仪中将混合物超声处理一分钟。然后进行冻融循环：先在干冰上放置五分钟，再放入温水中五分钟，重复此冻融循环四到五次。使用Avanti微型挤出器挤出脂质悬浮液。使用0.1微米聚碳酸酯滤膜及滤膜支撑装置安装小型挤出器，将悬浮液来回挤出21次，直至几乎透明的悬浮液出现在对侧注射器中，从而制备得到大单层囊泡（LUV）悬浮液。通过已用钠缓冲液平衡过的PD-10脱盐柱去除外部ANTS，将挤出后的悬浮液过柱。向柱中加入1.5毫升LUV悬浮液和1毫升钠缓冲液。当溶液完全进入层析柱后，用三毫升钠盐缓冲液洗脱脂质体，并收集洗脱液。所得的 A NTS 包封 LUV 原液应含有约 4 至 5 毫摩尔脂质，外观呈半透明、乳白色。用铝箔避光保护溶液，并在使用前24小时于13摄氏度保存，使用前充分涡旋振荡。ANTs填充的LUV储备溶液。由于UUVs的密度大于1克/毫升和/或会发生沉降。然后用钠缓冲液将装有 A NTS 的大单层囊泡（LUV）储备溶液稀释至 1:20。取四分之三的脂质体与 260 纳克溶于 DMSO 中的 abidin 孵育，向剩余的四分之一中加入等体积不含 gamin 的 DMSO。为了使所有样品中的溶剂浓度保持恒定，将格拉明在13摄氏度下于脂质囊泡的内层和外层单分子层之间平衡24小时。此处使用配备温度控制的Applied Photophysics SX.20停流光谱荧光仪来测定荧光猝灭速率。开始前，提前一小时开启仪器，以确保仪器充分预热。用于激发的狭缝应设置为1/1，记录发射时应使用55纳米的高通滤光片，并通过pro data SX软件进行。首先设置记录条件，将单色器的激发波长设为352纳米。使用压力保持设置。将时间设置为1秒，采样点设置为5,000。缓冲液运行的重复次数调整为9次，淬灭剂运行的重复次数调整为13次。在Essex软件的检查驱动程序配置文件中监测温度。驱动体积应设置为120微升，即从每支注射器中混合60微升，可获得约1.2毫秒的死时间。将荧光检测器的高压或增益调节至约420伏。目标是获得约八个荧光读数，将先前制备的装载了 A NTS 的 UUVs 在 25 摄氏度避光条件下平衡 10 分钟。平衡完成后涡旋样品，然后将其装入左侧注射器。在右侧注射器中装入钠缓冲液或铊淬灭剂。通过来回推动注射器排除任何气泡。两个注射器应等量装填。在关闭第一个样品的阀门之前，用钠缓冲液记录荧光信号。重复四次，并根据需要调整增益。然后对剩余样品再重复五次。用钠缓冲液记录九次重复。将钠缓冲液替换为铊淬灭剂，并记录13次重复。用水冲洗后，继续进行下一个样品的对照。包括不含生物碱的溶剂对照样品，以及不含生物碱但含有最高化合物浓度的样品。在进行荧光检测时，同时使用格拉明和溶剂，并将数据读入 MATLAB 软件进行分析。对于每个样本，需读取所有缓冲液和淬灭剂的重复数据，其中前四次重复会受到管路中先前残留物质的污染。在此情况下，信号来源于前次清洗残留的水与钠缓冲液样本混合所产生的结果。第五至第九次重复代表仅来自样品的信号，因此我们始终排除每组中的前四次重复。为避免混合伪影，需手动检查曲线轨迹，剔除任何异常的重复数据，例如因混合伪影或气泡导致出现尖峰或偏离的红色轨迹。然后将每个样品在每种实验条件下淬灭剂重复组的数据归一化为缓冲液重复组的平均起始值，将所有样品的平均值合并到一张可视化图中；不含格拉明的样品应结果相似，并显示几乎无荧光淬灭。对于含格拉明的样品，由于铊离子缓慢进入囊泡，荧光信号会缓慢降低。如果该化合物明显改变了荧光时间进程，则表明该化合物在所测试浓度下改变了脂双层性质；接下来，对归一化荧光淬灭曲线的前2至100毫秒数据拟合一个拉伸指数函数。对各个重复实验计算在两毫秒时的速率，然后根据各个重复实验计算给定样本的平均值和标准差。此处以 cap 表示的辣椒素对荧光淬灭时间过程的影响，在无或有以 ga 表示的格列胺存在条件下进行观察，归一化的荧光信号在此处显示为一秒内的变化。灰色圆点代表所有重复实验的结果，而红色线条代表平均值。展示了归一化荧光信号的前100毫秒。灰色点表示每种条件下单次重复的实验结果。红色线条是对这些重复数据进行拉伸指数拟合的结果。被抑制的蓝线表示两毫秒的时间点，即淬灭速率的测定时刻。通过将数据归一化到含有格拉明但无修饰剂的对照样品，来确定淬灭速率的相对变化。当辣椒素结合到脂双层时，会改变脂双层的性质。脂双层变软的变化将反映为单体-二聚体平衡向有利于导电型二聚体的方向移动，表现为色氨酸侧的偏移。我们刚刚向您展示了一种用于测定小分子对脂双层扰动效应的实验方法。进行此操作时，重要的是要记住，每次实验均需使用同一批次的囊泡，并设置适当的对照。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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