单细胞转染鸡胚

本实验的总体目标是将编码绿色荧光蛋白的质粒注射到鸡胚体节或神经管的单个细胞中。首先，需拉制具有合适尖端开口直径的显微注射玻璃针。实验的第二步是制备用于注射的质粒储备液。

该操作流程的第三步是准备用于注射的胚胎。第四步是用质粒DNA装载微量移液管。最后一步是向目标组织进行注射。

最终，可以通过免疫荧光显微镜获得结果，显示在选定的体节和神经管亚区中，单个标记的前体细胞所产生的衍生物在细胞数量上的范围。大家好，我是来自耶路撒冷希伯来大学医学神经生物学系Heim教授实验室的Rael。今天我们将向您展示一种对鸡胚体节和神经管进行单细胞注射的操作方法。

我们在实验室中采用此方法研究某些细胞和神经管细胞的谱系分离。现在开始介绍如何在鸡胚中获得单个转染细胞：首先制备显微注射针。我们使用标准的Naga PP 83型拉针仪制备注射针，加热设定值为13.5。

必须精确校准设置，以获得直径在8至10微米之间的移液管尖端。我们使用含有Boris硼硅酸盐玻璃管的毛细管，其外径为1毫米，内径为0.75至0.78毫米。您也可以使用市售的微移液管，其外径为1毫米、内径为0.75毫米，且不含细丝。

制备好的移液管应存放于塑料培养皿中，并确保管尖避免接触培养皿边缘。为准备显微注射用的DNA，需将目标质粒转染至DH5α大肠杆菌中。次日按照标准操作流程，使用大量提取试剂盒（Maxi prep kit）纯化质粒。对于非克隆注射，我们采用每微升1微克（1 µg/µL）的DNA浓度。

对于需要单个克隆的实验，质粒浓度应显著降低，并需进行相应调整。对于P-C-A-G-G-F-P-A，每微升0.05至0.1微克的浓度效果较好。一旦确定最佳浓度，我们建议将全部纯化的质粒储备液稀释至预定浓度，而不是对单个样品分别进行稀释。

后者可能会导致成功率出现一定差异，这可能是由于纯度及其他参数（如超螺旋质粒的比例）不同所致。为显微注射制备鸡胚时，将处于所需发育阶段、并在孵化过程中保持长轴水平放置的鸡蛋用70%乙醇擦拭，随后使其干燥。接着，用手术剪刺穿蛋的尖端。使用10毫升注射器和19号针头从蛋内抽取2毫升蛋清，并在注射前用热石蜡密封穿刺孔。

使用手术剪在蛋壳顶部开一个窗口，以防止碎屑进入孔中。在窗口上贴一片胶带，然后穿过胶带剪出一个孔。为了便于观察胚胎，可将连接在吸管上的经火焰拉制的毛细管插入胚下腔，注入无毒墨水（如Pelican 17号墨水）。

接下来，使用安装在持针器上的0.14毫米昆虫针切开并移开重要的和/或羊膜，将DNA加载到拉制好的移液管Eloqua中，并利用毛细作用加入少量快绿染料粉末。用适当直径的质粒毛细管连接到吸管装置上，吸取极少量的质粒溶液。然后将其插入移液管远离尖端的一端，并尽可能靠近尖端处加载DNA。

接下来，将移液管连接到安装在显微操作仪上的手动气压注射装置。如有必要，施加最小量的压力，使质粒溶液到达移液管尖端。在将移液管插入卵细胞的液体介质时，持续施加一定气压，以防止移液管尖端堵塞。

一旦穿刺到相关组织区域，压力的变化通常足以释放质粒并可见快绿染料。如果未发生此现象，可轻微按压注射器，直至质粒与快绿混合物被推出。沿胚胎轴线重复此操作，必要时可加入注射用 PBS。

最后，用胶带密封窗口，并将卵放回培养箱中。避免通风，并在培养箱内放置盛有水的小容器，以帮助维持湿度并提高产量。如果注射靶位较浅且易于观察，例如位于体节背侧、神经管或外胚层内，则可通过荧光体视显微镜进行整体封片观察，以评估实验的成功率。

此步骤对于评估标记的细胞数量是否过多或过少尤为有帮助。若需继续孵育，可在观察后向卵内加入含抗生素的 PBS 溶液，并更换封口胶带。此外，还可通过连续切片胚胎并进行免疫组织化学染色，来评估注射操作的成功率。

注射后四小时或更长时间，将胚胎固定并进行石蜡切片处理。将玻璃载片上的切片脱蜡处理后，进行免疫染色以可视化报告基因表达，可选用生物素-链霉亲和素等信号放大方法。最后，对连续切片进行扫描，以检测注射节段中标记的细胞。

如果在初次试验中获得的是多个而非单个细胞，必须稀释质粒储备液并重复该过程，直至获得理想结果。我们通常对每个螨虫注射一次 P-C-A-G-G-F-P，同时每枚胚胎靶向 6 至 12 个节段。在此条件下，注射后 8 小时通过整体封片观察，可在每 10 枚胚胎中至少 1 枚的至少 1 个节段中检测到清晰的信号。

在此示例中，向某螨虫注射了编码 GFP 的质粒，五小时后，在此处所示的胚胎整体装片视野中观察到单个荧光细胞。在向中央螨虫注射 24 小时后，于克隆注射两天后的整体装片胚胎中观察到一群荧光细胞。对该区域进行切片显示，克隆后代同时存在于真皮和肌肉中，表明单个前体细胞可产生这两种衍生成分。

至于体节，背侧神经管中的单个神经上皮前体细胞也可以被刺入，如此处注射后五小时拍摄的横截面所示。连续切片分析显示，当成功率约为10%时，可实现克隆性转染。这意味着，为了达到克隆性，该技术在定义上效率极低。另一方面，在这些条件下，超过93%的阳性标记事件被证实为克隆来源。

我们刚刚向您展示了在此操作中如何对鸡胚的单个细胞进行注射。需要注意的是，在进行单细胞感染时，应将大量储存的质粒稀释至理想浓度，并在后续实验中始终使用该浓度。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。