Name: 单细胞转染鸡胚 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习使用显微注射技术对鸡胚体节或神经管进行单细胞转染，通过绿色荧光蛋白标记追踪基因表达和细胞谱系。该方法为发育生物学研究提供了可靠的克隆细胞群分析工具。

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感谢Shlomi Krispin提供神经管图像。特别感谢Yuval Cinnamon建立了GFP转染技术。本研究得到了以色列科学基金会、法国肌病协会以及德国研究基金会合作研究中心488（C.K.）项目的资助。

1. 微量移液管的制备
我们使用标准的Narishige pp-83拉针仪来制备玻璃微电极，加热设定值为13.5。具体的设定值需要进行校准，目标是使微电极尖端直径在8至10微米之间。我们采用含有丝状物的硼硅酸盐玻璃管，其外径为1.0 mm，内径为0.75–0.78 mm。制备后的微电极应存放在塑料培养皿中，并确保尖端避免接触培养皿边缘，以保护尖端不受损伤。
2. DNA 制备
将目的质粒通过标准操作转染至 DH5α E. coli 中。利用单菌落的过夜培养物，使用大提试剂盒（任何商业试剂盒均可）纯化质粒。非克隆注射时，我们使用 1.0 μg/μL 的质粒浓度；浓度过高会增加移液枪头堵塞的风险。对于克隆实验，质粒浓度需显著降低并进行调整（见下文）。对于 pCAGG-GFP，获得克隆结果的最佳浓度约为 0.05–0.1 μg/μL。每次实验通常使用 1–2 μL 质粒，并在实验开始前向质粒中加入极少量快绿染料粉末（用干燥、尖锐的玻璃移液管管尖蘸取）。随后将质粒在台式离心机中以最大速度离心 2 分钟。该步骤似乎有助于减少移液枪头堵塞问题。
3. 胚胎注射
3.1 胚胎的制备
我们使用鹌鹑蛋和鸡蛋进行注射。将鸡蛋平放在其长轴方向上孵化，直至达到所需的发育阶段。用70%乙醇擦拭鸡蛋表面，并使其干燥。用手术剪在鸡蛋的尖端刺一个小孔（此步骤仅对鸡蛋必需），然后用10 mL注射器（19G针头）从蛋内抽出1 mL（鹌鹑）或2 mL（鸡）的蛋清。随后用热石蜡密封小孔。
在实际注射前，使用手术剪在蛋壳顶部开一个窗口。将胶带贴在蛋壳上并进行切割，有助于减少蛋壳碎片的产生。立即用移液器将含有抗生素的PBS缓冲液加入蛋内。为了暴露胚胎，使用安装在持针器上的0.14 mm昆虫针切开并拨开卵黄膜和/或羊膜。使用连接在吸管装置上的火焰拉制毛细管，将无毒墨水（Pelican #17）注射到胚盘下方，以帮助可视化胚胎。
3.2 玻璃微电极的装载与安装
可使用适当直径的火焰拉制毛细管，将其安装到吸管器上，从而将质粒装入拉制的微电极毛细管中。用毛细管吸取少量质粒，从微电极钝端开口处将其装入，尽量从内部向尖端方向推进。随后将该微电极安装到固定于显微操作仪上的手动气压注射装置上。必要时施加最小压力，使质粒溶液到达微电极尖端。
3.3 质粒注射
将移液器插入卵的液体培养基中，同时施加一定的气压，以防止移液器尖端堵塞。刺穿目标组织区域。当尖端进入组织时，压力的变化通常足以释放含有可见亮蓝染料的质粒。如果未发生释放，则轻微推动注射器，直至质粒/亮蓝染料被推出。该过程可沿胚胎轴线重复进行，例如在相邻的体节或沿神经管全长进行注射。注射完成后，可加入磷酸盐缓冲液（PBS）。使用胶带封闭开窗（不建议使用石蜡膜，尤其是鹌鹑蛋——其可能阻碍氧气通过蛋壳交换，从而增加胚胎死亡率）。将处理后的胚胎放回培养箱中。避免通风，并在培养箱内放置盛有水的小容器，以帮助维持湿度，提高实验成功率。 
4. 调整注射参数并监测成功率
评估和校准各种注射参数对于旨在进行单细胞分析的应用至关重要。并非每次注射操作都能成功标记单个细胞。质粒浓度过高会导致非克隆性标记，而浓度过低则会导致较高的失败率。注射用质粒的浓度必须优化，以实现克隆性注射。我们建议将全部纯化的质粒储备液进行稀释，而不是将各个制备样品分别稀释至预定浓度。后者可能会引入成功率的差异，可能与纯度差异及其他参数（如超螺旋质粒的比例）有关。
4.1 通过整体封片观察评估成功率
可通过荧光体视显微镜对注射后的胚胎进行整体观察，以进行初步评估。使用pCAGG增强型GFP构建体时，注射后6至8小时即可评估实验成功率，前提是靶向部位足够表浅而易于观察（例如背部体节、背部神经管、外胚层等，见图1A-C）。此步骤对于评估标记细胞过多或完全缺乏荧光细胞的实验系列尤为有帮助。若需进一步孵育，应在观察后向卵内添加含抗生素的PBS溶液，并更换封口胶带。
4.2 通过连续切片分析评估克隆性
评估注射成功率的最佳方法是对注射后的胚胎进行连续切片，并通过免疫组织化学染色来观察标记细胞。在此条件下，孵育时间可短至注射后4小时。胚胎经固定后进行石蜡包埋切片（或冷冻切片）处理。将载玻片上的切片脱蜡后，进行免疫染色以显示报告基因的表达。根据需要可采用生物素-链霉亲和素等信号放大方法。最后，扫描连续切片以检测注射节段中标记细胞的存在情况。若在初步实验中获得多个而非单个细胞，必须稀释质粒储备液并重复实验，直至获得理想结果。当成功率过高时，可能需要对质粒储备液进行2至10倍的稀释。
对于每一种要转染的质粒，都应重复进行彻底的校准以确保单克隆性。
5. 典型结果
我们通常对每个体节进行一次 pCAGG-GFP 注射，每枚胚胎靶向 6–12 个体节1 2。在此条件下，注射后 8 小时通过整体标本观察即可检测到清晰的信号，在十枚胚胎中至少有一枚胚胎的至少一个体节中可观察到信号。在这些条件下，标记进一步被证实为单克隆性（图 1B,C）。当使用高浓度 DNA 时，大多数胚胎可能至少出现一次成功的注射，但存在多个细胞被转染的可能性。
连续切片分析显示，当成功率为约10%时，可获得单克隆转染。这意味着，根据定义，为实现单克隆性，该技术效率极低。另一方面，在这些条件下，超过93%的阳性标记事件被证实为单克隆来源1。
<img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="神经组织显微图像；荧光成像；细胞结构分析；神经发育。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 将pCAGGS-GFP克隆注射至神经和骨骼祖细胞中。 （A-C）横切面显示，在向单个祖细胞微量注射pCAGGS-GFP后6小时，背侧神经管（NT）（A）、皮肌节（DM）的腹外侧区域（B）或皮肌节中央层（C）的标记情况。（D）在对皮肌节中央区域进行克隆转染两天后，单个祖细胞产生了真皮（D）和肌肉（M）两种衍生物（详见参考文献1）。

<ol><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li>
<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium%2C+smooth%2C+and+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li>
<li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. </a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

上述方法是对先前描述的技术的一种改进，用于将脂溶性染料递送至少量细胞亚群或单个前体细胞 3与标准的电穿孔技术相比，它具有三个主要优势。第一，它能够可靠地标记目标组织中的特定部位，从而实现比电穿孔更高的空间分辨率（例如见图1B、C）。第二，它可实现单个细胞的标记，进而能够追踪其谱系 体内 在其他条件正常的情况下 1 2 （图1C，D）。第三，在单细胞水平上进行基因的异常表达为研究谱系分离的分子机制、探究生长因子或其他基因在正常背景下对细胞行为的作用等提供了工具。因此，该方法是对广泛应用的电穿孔技术的补充，并进一步利用了禽类胚胎在时空上调控基因功能获得与缺失的可操作性。 体内.
一个日益重要的应用是利用新兴的活体成像技术，在单细胞水平上分析细胞行为（如细胞迁移、轴突导向、细胞分裂等）4 5 6 7。在某些实验条件下，使用快速激活的报告分子（例如 Venus-GFP）8 可能更为理想，以便更早地观察被注射的细胞。
<p class="jove_conte...

<table><tbody><tr><td>移液管</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>2-000-100</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Watkins Doncaster</td><td>E6871</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

鸡胚中的单细胞转染

Single Cell Transfection in Chick Embryos

发育生物学的一个核心主题是细胞谱系的多样化及其潜在分子机制的阐明。这需要对单个细胞在正常和实验条件下的命运进行深入分析。为此，靶向单个前体细胞的转染方法是先决条件。本文介绍一种技术上简便的方法，可在鸡胚体内（in-ovo）对组织中的单个细胞进行转染，从而实现可靠的谱系示踪以及基因操作。该方法可特异性靶向体节或神经管内的特定组织区域，并将DNA直接注射到目标上皮组织中，从而实现单个细胞的随机转染。通过使用报告基因，可对克隆细胞群体进行长达三天的追踪，并可将经基因操作的克隆群体行为与对照组进行比较。该方法充分利用了鸡胚易于操作的特点，以及新兴的基因操作工具。我们比较并讨论了该方法相较于广泛使用的电穿孔技术的优势，同时提出了其可能的应用前景及在其他体内（in-vivo）模型中的适用性。我们主张将该方法作为现有谱系示踪和基因干扰工具的重要补充和扩展。

使用细尖微量移液器，我们将质粒DNA注射到鸡胚体节或神经管的亚区域中。通过调整质粒浓度以获得单个转染细胞。随后，我们让这些细胞发育形成克隆群体。

发育生物学的一个核心主题是谱系的多样化及其潜在分子机制的阐明。这需要……

本实验的总体目标是将编码绿色荧光蛋白的质粒注射到鸡胚体节或神经管的单个细胞中。首先需要制备具有合适尖端开口直径的显微注射玻璃针。实验的第二步是制备用于注射的质粒储备液。该操作流程的第三步是准备用于注射的胚胎。第四步是用质粒DNA装载微量移液管。最后一步是向目标组织进行注射。最终，可以通过免疫荧光显微镜获得结果，显示在选定的体节和神经管亚区中，单个标记的前体细胞所产生的衍生物在细胞数量上的范围。大家好，我是来自耶路撒冷希伯来大学医学神经生物学系Heim教授实验室的Rael。今天我们将向您展示一种对鸡胚体节和神经管进行单细胞注射的操作方法。我们在实验室中采用此方法研究某些细胞和神经管细胞的谱系分离。现在开始介绍如何在鸡胚中获得单个转染细胞：首先制备显微注射针。我们使用标准的Naga PP 83型拉针仪制备注射针，加热参数设置为13.5。必须精确校准设置，以获得直径在8到10微米之间的移液管尖端。我们使用含有Boris硅酸盐玻璃管的毛细管，其外径为1毫米，内径为0.75至0.78毫米。您也可以使用市售的微移液管，其外径为1毫米，内径为0.75毫米，但不含细丝。制备好的移液管保存在塑料培养皿中，并确保管尖避免接触培养皿边缘。为准备显微注射用的 DNA，将目的质粒转染至 DH5α 大肠杆菌中。次日采用标准操作流程，使用大提试剂盒（Maxi prep kit）纯化质粒；对于非克隆注射，我们使用 1 µg/µL 的 DNA 浓度。对于需要单个克隆的实验，质粒浓度应显著降低，并需进行相应调整。对于P-C-A-G-G-F-P-A，每微升0.05至0.1微克的浓度效果较好。一旦确定最佳浓度，我们建议将全部纯化的质粒储备液稀释至预定浓度，而不是对单个样品分别进行稀释。后者可能会导致成功率出现一定差异，这可能与纯度及其他参数的差异有关，例如超螺旋质粒的比例。用于显微注射的鸡胚需在水平放置的长轴方向上孵化至所需发育阶段，然后用70%乙醇擦拭表面并使其干燥。接着，用手术剪刺穿蛋的尖端。使用10毫升注射器和19号针头从蛋内抽取2毫升蛋清，并在注射前用热石蜡密封穿刺孔。使用手术剪在蛋壳顶部开一个窗口，以防止碎屑进入孔中。在窗口上贴一片胶带，然后穿过胶带剪出一个孔。为了便于观察胚胎，可将连接在吸管上的经火焰拉制的毛细管插入胚下腔，注入无毒墨水（如Pelican 17号墨水）。接下来，使用安装在持针器上的0.14毫米昆虫针切开并移开重要的和/或羊膜，将DNA装入拉制的移液管Eloqua中，并利用毛细管加入少量快绿粉末。用吸管将适量直径的质粒毛细管吸取极少量液体。然后将其插入移液管的另一端（与尖端相对的一端），尽可能靠近尖端处加载DNA。接下来，将移液管连接到安装在显微操作仪上的手动气压注射装置。如有必要，施加最小量的压力，使质粒溶液到达移液管尖端。在将移液管插入卵细胞的液体介质时，持续施加一定气压，以防止移液管尖端堵塞。一旦穿刺到相关组织区域，压力的变化通常足以释放质粒并可见快绿染料。如果未发生此现象，则轻轻按压注射器，直至质粒与快绿混合物被推出。沿胚胎轴线重复此操作，必要时可加入注射用 PBS。最后，用胶带密封窗口，并将卵放回培养箱中。避免通风，并在培养箱中放置盛有水的小容器，以帮助维持湿度并提高孵化率。如果注射靶位较浅且易于观察，例如位于背部体节、神经管或外胚层内，则可通过荧光体视显微镜进行整体封片观察，以评估实验的成功率。此步骤对于评估标记的细胞数量是否过多或过少特别有帮助。如果需要进一步孵育，可在观察后向卵内加入含有抗生素的 PBS 溶液，并更换封口胶带。此外，可通过连续切片胚胎并进行免疫组织化学染色来评估注射实验的成功率。注射后四小时或更长时间，将胚胎固定并进行石蜡切片处理。将玻璃载片上的切片脱蜡至水后，进行免疫染色以可视化报告基因表达，可选用生物素-链霉亲和素等信号放大方法。最后，对连续切片进行扫描，以检测注射节段中标记的细胞。如果在初次试验中获得的是多个而非单个细胞，必须稀释质粒储备液并重复该过程，直至获得理想结果。我们通常对每个螨虫注射一次 P-C-A-G-G-F-P，同时每枚胚胎靶向 6 至 12 个节段。在此条件下，注射后 8 小时，通过整体封片观察可在每 10 枚胚胎中至少 1 枚的至少 1 个节段中检测到清晰的信号。在此示例中，向一只螨虫注射了编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒，五小时后，在此处所示的胚胎整体装片视野中观察到单个荧光细胞。在向中央螨虫注射24小时后，于克隆注射两天后的整体装片胚胎中观察到一群荧光细胞。对该区域进行切片显示，克隆后代同时存在于真皮和肌肉中，表明单个前体细胞可产生这两种衍生成分。至于体节，背侧神经管中的单个神经上皮前体细胞也可以被刺入，如此处所示的横切面图像所示，该图像为注射后五小时拍摄。连续切片分析显示，当成功率约为10%时，可实现克隆性转染。这意味着，为了达到克隆性，该技术在定义上效率极低。另一方面，在这些条件下，超过93%的阳性标记事件被证实为克隆来源。我们刚刚向您展示了在此操作中如何对鸡胚的单个细胞进行注射。需要注意的是，在进行大量质粒储备液的单细胞感染时，应将其稀释至理想浓度，并在后续实验中始终使用该浓度。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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